蛋白質(zhì)定性定量分析

1、關(guān)于蛋白質(zhì)的定性定量分析第一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質(zhì)定性分析 (qualitative analysis) 確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在，以及存在的是何種蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)定量分析 (quantitative analysis) 確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量第二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質(zhì)含量的測定方法（重點(diǎn)掌握） 蛋白質(zhì)相對分子量測定 (SDS) 等電聚焦電泳 (IEF)（一般了解） 蛋白質(zhì)的免疫印跡分析 (western blot)第三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一章 蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定基于蛋白質(zhì)的

2、元素組成特點(diǎn)基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的光吸收特性第四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16 由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % ) = 每克樣品含氮克數(shù) 6.251001/16%第五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、紫外光譜 (A280)吸收法 這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰第六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月原 理 色氨酸、酪氨酸的最大

3、吸收峰在280 nm附近 大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu) 點(diǎn) 快速缺 點(diǎn) 核酸可引起強(qiáng)干擾作用芳香族氨基酸含量差異可以起誤差 對蛋白質(zhì)無破壞性 不是嚴(yán)格的定量，適用于測定蛋 白質(zhì)粗提液 第八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 蛋白質(zhì)濃度 (mg/ml) =1.45A280-0.74A260注意事項(xiàng) 石英比色杯 調(diào)零所用溶液 配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液 光密度范圍第九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、考馬斯亮藍(lán)G

4、-250檢測法 這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法第十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月原 理 該法是基于考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595 mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595 mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量第十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月所需時(shí)間 10 min優(yōu) 點(diǎn) 快速（反應(yīng)時(shí)間僅需2 min） 敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)損失缺 點(diǎn) 用這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不 可逆的變性 對各種純化

5、蛋白質(zhì)反應(yīng)不同第十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng) 反應(yīng)1015 min后開始出現(xiàn)沉淀， 尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條 件下易發(fā)生沉淀 若選用目的蛋白來做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用 另一種方法來校正，所測蛋白濃度 較準(zhǔn)確第十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三、Lowry檢測法 這一標(biāo)準(zhǔn)、快速的蛋白質(zhì)定量檢測方法已得到廣泛應(yīng)用.第十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月原 理 首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745 750 nm處有最大的

6、吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750 nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量第十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu) 點(diǎn) 一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法 不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺 點(diǎn) 某些試劑不穩(wěn)定 干擾物質(zhì)多 使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性第十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng) 在加入試劑30 min后呈色達(dá)到飽 和，時(shí)間延長顏色信號減弱 許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng) 高鹽濃度可引起沉淀第十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月四、BCA (二喹啉甲酸)檢測法 這是近年來新研制的一種改進(jìn)的Lowry測定法第十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作

7、于2022年6月原 理 在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2還原成Cu。而BCA試劑可敏感特異地與Cu結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量第十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu) 點(diǎn) 檢測敏感性高缺 點(diǎn) 蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性 終產(chǎn)物穩(wěn)定巰基試劑和去垢劑干擾第二十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 蛋白質(zhì)相對分子量測定分子量測定 (molecular weight, MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜 (ESI-MS)第二十

8、一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、SDS測定蛋白質(zhì)的相對分子量1. 不連續(xù)系統(tǒng)原理2. SDS凝膠的制備制備分離膠制備濃縮膠加樣裝板電泳卸板并進(jìn)行凝膠染色第二十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3. SDS基本原理 SDS 影響遷移率的因素 十二烷基硫酸鈉 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸鈉 (Sodium Dodecyl Sulfonate ) 第二十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 SDS作用：與蛋白牢固結(jié)合，當(dāng)其濃度大于1 mmol/L 時(shí)，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為 1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電

9、荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異第二十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數(shù)線性關(guān)系 Watch SDS原理第二十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4. SDS測定分子量的操作 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及處理 待測樣品的制備 電泳分離及染色 相對遷移率的計(jì)算Watch SDS操作第

10、二十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Analysis for SDSelectrophoresis第二十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 注意事項(xiàng) 選擇合適的膠濃度 樣品中高濃度的陽離子可能會導(dǎo)致SDS的沉 淀，應(yīng)在加入樣品緩沖液之前將其除去 SDS與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合程度 蛋白質(zhì)的分子量范圍 15200 KD之間 二硫鍵是否完全被還原 溶液中SDS的濃度 溶液的離子強(qiáng)度第二十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 多亞基蛋白質(zhì)分子量檢測 用其它方法測定分子量進(jìn)行參照 SDS和巰基乙醇 SDS測定的準(zhǔn)確性 電荷異?；驑?gòu)象異常 帶有較大輔基的蛋白質(zhì) 某些結(jié)構(gòu)蛋白第

11、二十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、凝膠過濾層析測定蛋白質(zhì)的相對分子量1. 基本原理2. 凝膠過濾測定分子量的操作 分子篩效應(yīng) 洗脫體積與相應(yīng)分子量的關(guān)系裝柱平衡加樣平衡洗脫收集樣品并計(jì)算Ve繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線第三十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 注意事項(xiàng) 柱床表面不能干燥 凝膠的選擇 Sephadex 溶脹 G值的意義 凝膠柱的再生與保存第三十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第 三 節(jié) 等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第三十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月等電點(diǎn) (isoelectric poi

12、nt, pI)兩性電解質(zhì)性質(zhì)支持介質(zhì) (supporting media)Figure of IEF第三十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10Isoelectric Focusing第三十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月ReadyStripTM IPG Strips310473658710310NL3.95.14.75.95.5-6.76.3-8.3High-purity monomersNarrow ranges for resolution o

13、f low-abundance proteinsOverlapping gradients for “cyber gels”Three lengths 7 cm, 11 cm and 17 cm 0.5 mm x 3.3 mm第三十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Broad RangepH 3-10Narrow RangepH 4-7Micro RangepH 4.7-5.931044774.75.94.75.9第三十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng) 兩性電解質(zhì)的選擇 電極緩沖液 對樣品的要求 樣品必須無鹽 加樣的量要適當(dāng) 加樣方法 加樣位置第三十八張，PPT共

14、五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 蛋白質(zhì)的免疫印跡分析第三十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 印跡技術(shù) (blotting)是指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）于或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù) 1975年，Edwen Southern提出了分子印跡(漬)的概念 目前這種技術(shù)已被廣泛用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測第四十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用 DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析 RNA印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 蛋

15、白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究 由于蛋白質(zhì)常用抗體來檢測，因此也被稱為 免疫印跡技術(shù) (immunoblotting)第四十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、免疫印跡分析的應(yīng)用 對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析 對蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析生物大分子相互作用分析第四十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月將蛋白質(zhì)固定在膜上的其他應(yīng)用 結(jié)構(gòu)域分析 斑點(diǎn)印跡 抗體純化 為制備抗體時(shí)獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原 蛋白質(zhì)鑒定：氨基酸組成分析和序列分析第四十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、免疫印跡分析的基本流程 電泳分離蛋白

16、 轉(zhuǎn)移至固相膜 封閉非特異結(jié)合位點(diǎn) 與第一抗體溫育反應(yīng) 與第二抗體交聯(lián)物溫育反應(yīng) 顯色制備蛋白樣品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移抗體檢測第四十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫印跡操作流程圖第四十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 樣品的制備 組織或細(xì)胞中提取 裂解 去污劑 (SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20) 蛋白酶抑制劑 (PMSF、EDTA、Pepstatin、 Leupeptin、Aprotinin) 蛋白質(zhì)的定量 (Bradford、BCA、Lowry) 基因工程表達(dá)重組產(chǎn)物第四十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 電泳分離 SDS

17、 非變性PAGE EIF第四十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移方法：半干法、濕法 作用：將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 注意：在疊放硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，膜與膠之間要緊密貼在一起，中間不能有任何氣泡 ??？第四十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜種類 微孔大小 結(jié)合能力 特點(diǎn)NC膜0.45 um80-100 ug/cm2應(yīng)用廣泛 20kD易丟失PVDF膜0.22 um0.45 um80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kD不易丟失容量大、強(qiáng)度高尼龍膜480 ug/cm2用于核酸第四十九張，PPT共五

18、十九頁，創(chuàng)作于2022年6月電轉(zhuǎn)移裝置第五十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月電轉(zhuǎn)移示意圖第五十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月電轉(zhuǎn)移裝置第五十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 靶蛋白的免疫學(xué)檢測 封閉 對轉(zhuǎn)移膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉 ，防止抗體非特異性結(jié)合在膜上，降低背景顏色BSA、脫脂奶粉 第五十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 靶蛋白與第一抗體反應(yīng) 單抗、多抗 注意：設(shè)立陽性對照和陰性對照，陰性對照可用免疫前血清、非相關(guān)單克隆抗體；陽性對照可用已知靶蛋白等 作用：排除假象第五十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 與第二抗體反應(yīng) 第二抗體一般是針對第一抗體的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記 酶標(biāo)抗體常用酶：堿性磷酸酶( alkaline phosphatase，AKP ) 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)膠體金標(biāo)記、125I標(biāo)記標(biāo)記第五十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 顯色 AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷