DNA測(cè)序常見問題及其分析

1、測(cè)序常見問題及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)出現(xiàn)重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼）圖1-1圖1-2解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測(cè)序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序。問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）圖2解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充

2、分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序，便可解決。問題圖3（測(cè)序引物有堿基缺失）測(cè)序引物有堿基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測(cè)序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測(cè)序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化2、克隆測(cè)序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測(cè)序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測(cè)序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y(cè)序。3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)模板中有雜合型突變，也就說模

3、板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測(cè)序。4、poly A/T和C/G cluster導(dǎo)致的套峰和測(cè)序信號(hào)衰減圖4-1圖4-3圖4-4RACE測(cè)序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測(cè)序；但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測(cè)序公司的本事了。C/Gcluster在PrV基因組測(cè)序時(shí)遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時(shí)候卻不得不用它們的

4、產(chǎn)品和服務(wù)。5、基因中含有重復(fù)序列可能的原因:樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致Frame滑動(dòng)，較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長的重復(fù)序列會(huì)使定序信號(hào)衰減。解決辦法:反向測(cè)序有時(shí)能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域(但不是一定都能夠)，通過多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，拼接可以得到全序列結(jié)果。TT測(cè)序結(jié)果常見的幾個(gè)問題TT(From: HTUTUUUTTH )1 、 為什么開始一段序列的信號(hào)很雜亂，幾乎難以辨別?這主要是因?yàn)闅埓娴娜玖蠁误w造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測(cè)序電泳開始階段電壓有一個(gè)穩(wěn)定期，所以經(jīng)常有20-50 bp 的緊接著引物的片

5、段讀不清楚，有時(shí)甚至更長。 2 、 為什么在序列的末端容易產(chǎn)生 N 值，峰圖較雜?由于測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)是逐漸減弱的，所以序列末端的信號(hào)會(huì)很弱，峰圖自然就會(huì)雜亂，加上測(cè)序膠的分辨率問題，如果堿基分不開，就會(huì)產(chǎn)生 N 值，正常情況下ABI377測(cè)序儀能正確讀出500個(gè)堿基的有效序列。 3 、 測(cè)序結(jié)果怎么找不到我的引物序列?如果找不到測(cè)序所用的引物序列。這是正常的，因?yàn)橐锉旧硎遣槐粯?biāo)記的，所以在測(cè)序報(bào)告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴(kuò)增引物，可能是您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴(kuò)增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時(shí)需找引物

6、的互補(bǔ)序列。 4 、 測(cè)序結(jié)果怎么看不到我克隆的酶切位點(diǎn)?可能的原因同上，您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點(diǎn)。通常我們會(huì)盡量選擇距離酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)點(diǎn)的引物，當(dāng)然，若是樣品出現(xiàn)意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點(diǎn)也是看不到的。 5 、 你測(cè)出的結(jié)果與我預(yù)想的不一致，給我的結(jié)果與我需要的序列有差距，這是怎么回事?首先，我們會(huì)核實(shí)給您的測(cè)序結(jié)果是否對(duì)應(yīng)您的樣品編號(hào)，如果對(duì)應(yīng)的是您的樣品，由于不知您的實(shí)驗(yàn)背景，測(cè)得的序列是否與您預(yù)想的結(jié)果一致我們無法判斷，我們能做到的是檢查發(fā)送給您的測(cè)序結(jié)果和您提供來的樣品是否一致。 6 、 序列圖為

7、什么會(huì)有背景噪音(雜帶)?是否會(huì)影響測(cè)序結(jié)果?序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強(qiáng)會(huì)影響測(cè)序結(jié)果，要看信噪比，我們給的結(jié)果信噪比大都在98%以上。 7 、測(cè)序 結(jié)果為什么與標(biāo)準(zhǔn)序列有差別？原因可能有： 樣品個(gè)體之間的差別、測(cè)序準(zhǔn)確率的問題，自動(dòng)測(cè)序儀分析序列的準(zhǔn)確并非100%，建議至少測(cè)一次雙向，通過雙向測(cè)序可以最大限度減少測(cè)序的錯(cuò)誤。當(dāng)然盡管我們有時(shí)做了最大努力，但還是保證不了和文獻(xiàn)序列完全一致，但我們測(cè)序報(bào)告是客戶樣品序列的真實(shí)結(jié)果。 8 、 PCR 產(chǎn)物測(cè)序與克隆后測(cè)序序列為什么有差別?PCR 產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序，有兩個(gè)方面可能序列有變化：首先， PCR 擴(kuò)增過程中可能產(chǎn)生錯(cuò)

8、配。將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變；其次，測(cè)序的準(zhǔn)確率并非100%。 9 、 有雜合位點(diǎn)，但你們的報(bào)告上看不到雜合的信號(hào)！如果在您認(rèn)為應(yīng)該出現(xiàn)雜合信號(hào)的位置上只出現(xiàn)單一的信號(hào)，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒達(dá)到可以測(cè)出的濃度。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會(huì)自動(dòng)將它作為背景信號(hào)了，很難檢測(cè)出來。只有當(dāng)測(cè)序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時(shí)，才能較可靠地檢測(cè)到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號(hào)強(qiáng)度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在，因?yàn)?，測(cè)序儀是主要用來測(cè)序正常的堿基序

9、列的，軟件分析結(jié)果時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。尊重結(jié)果，我們是不會(huì)人為將出現(xiàn)單一的信號(hào)修改為雜合位點(diǎn)的。 10 、 DNA 測(cè)序樣品用 TE 溶液溶解好不好?由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測(cè)序反應(yīng)也是 Taq 酶的聚合反應(yīng)，需要一個(gè)最佳的酶反應(yīng)條件,因此 DNA 測(cè)序樣品溶解時(shí)，最好用滅菌水溶解。 11 、 我送什么形式的菌體樣品好?菌體的一般形態(tài)有、菌液，平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態(tài)以方便且不易受污染為準(zhǔn)則，推薦穿刺培養(yǎng)菌。 上海客戶用過夜培養(yǎng)好的菌液2 ml 。 12 、 為什么你們給我的

10、序列是反的?測(cè)出來的結(jié)果與您預(yù)期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產(chǎn)物 T/A 克隆中較常見。有時(shí)，客戶要求的測(cè)序引物離克隆位點(diǎn)較近，如果反向引物相對(duì)克隆位點(diǎn)較遠(yuǎn)，為得到更好的結(jié)果，我們會(huì)選擇反向引物測(cè)序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉(zhuǎn)過來，就可得到正向序列。 13 、 Template mixed 為何種情況?測(cè)序結(jié)果表現(xiàn)為套峰，測(cè)序反應(yīng)信號(hào)很好，測(cè)序結(jié)果雜亂,即同一個(gè)位置有二個(gè)峰。原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產(chǎn)物中有雜帶、質(zhì)粒為雙克隆產(chǎn)物、引物特異性不高，有兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)， PCR 產(chǎn)物電泳時(shí)看不出，但測(cè)序結(jié)果能清楚地說明這點(diǎn)。 1

11、4 、 polyT 或 polyA 后峰圖雜，怎么也要收費(fèi)?這種情況一般表現(xiàn)為 A 、 T 連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰，是樣品的內(nèi)在原因。這類問題我們應(yīng)該同正常測(cè)序一樣，給客戶報(bào)告，反應(yīng)按正常收費(fèi)。 15 、 我的引物做 PCR 條帶很好，但為什么測(cè)不出序來？并不是能做 PCR 反應(yīng)的引物都能測(cè)序，測(cè)序所用引物要求較高,必須與模板完全匹配（有時(shí) 5 端可以有個(gè)別堿基的簡并），引物長度一般為20個(gè)堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測(cè)序的引物一定要足夠純。 16 、如果 我的菌種培養(yǎng)得很好，測(cè)序應(yīng)該不會(huì)有問題吧?對(duì)于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 ， DH1 、 和 C600 E.coli

12、菌株也可， XL1-Blue E.coli 菌株也不錯(cuò)，但其生長過慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產(chǎn)生大量的碳水化合物（即糖），而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用；其它宿主菌可能會(huì)對(duì)測(cè)序造成影響。 17 、 為什么 G/C rich 的樣品沒結(jié)果或結(jié)果不好，照常收費(fèi)?由于 G/C 連續(xù)結(jié)構(gòu)有時(shí)會(huì)造成反應(yīng)中途無法正常進(jìn)行，如果結(jié)構(gòu)在引物下游近處，反應(yīng)只有一小段的信號(hào)，有時(shí)甚至反應(yīng)根本沒信號(hào)。對(duì)于這種情況，本身就潛在不確定性的測(cè)序，有很大的失敗因素。 18 、 PCR 產(chǎn)物150 bp 以下的為什么不適于直接測(cè)序?PCR 產(chǎn)物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難

13、，用于測(cè)序的 PCR 產(chǎn)物一般不低于150 bp 長度。一個(gè)150 bp 的 PCR 產(chǎn)物用于測(cè)序，去掉兩個(gè)引物的序列大約40到50 bp ， 再加上測(cè)序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過幾十堿基。這只是最理想的假設(shè)，這么短片斷測(cè)序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進(jìn)行測(cè)序。 19 、 我的質(zhì)粒樣品很好，測(cè)序結(jié)果怎不好?由于原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)如發(fā)卡和回文結(jié)構(gòu)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)突然信號(hào)減弱或消失；有時(shí)測(cè)序根本不能進(jìn)行下去， DNA 堿基排列并無特別異常，可能是 DNA 整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，反應(yīng)無法進(jìn)行。 20 、 我的樣品還保留了嗎?我想現(xiàn)在反向再測(cè)一個(gè)反應(yīng)。出于保密原則我們測(cè)序樣品只

14、保留一個(gè)月，所以若要再測(cè)序，請(qǐng)抓緊時(shí)間，否則只有重新送樣。 21 、 已經(jīng)測(cè)通了樣品，但重疊的地方有錯(cuò)配，是為什么?測(cè)通的全序列是拼接后的結(jié)果，由于拼接處一般是在一次測(cè)序的末端和次個(gè)反應(yīng)開始一段，通常會(huì)有一定的雜帶，以序列信號(hào)好的為主，次的為參考，但也不絕對(duì)。 常見峰圖及原因說明(From: HTUTUUUTTH )1.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)條帶單一，為什么測(cè)序結(jié)果說模板雜？2. 什么是堿基缺失？3. 什么是引物不純？4. 重復(fù)結(jié)構(gòu)對(duì)測(cè)序有哪些影響？5. 什么是模板不單一？6. Poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果是怎樣的？7. 含有回文結(jié)構(gòu)的模板測(cè)序結(jié)果是怎樣的？8. 測(cè)序峰圖為前雙峰的結(jié)果是什么樣的？9.

15、測(cè)序峰圖為后雙峰是什么樣的？10. 無信號(hào)的結(jié)果：信號(hào)值(ATGC的平均值)皆小于10011. 飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時(shí)堿基產(chǎn)生替代而出現(xiàn)堿基位移12. 沒有任何干擾的結(jié)果Q-1.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)條帶單一，為什么測(cè)序結(jié)果說模板雜？ A-1.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)的結(jié)果只是一個(gè)粗略的定性結(jié)果。對(duì)于與目的片段條帶大小只相差幾個(gè)堿基的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是無法用肉眼區(qū)分開的。但是DNA測(cè)序反應(yīng)敏感而客觀，可以直接反應(yīng)出模板本身的情況。需要強(qiáng)調(diào)的是，高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物才可能得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，如果您對(duì)PCR產(chǎn)物的純度不很確定，希望您可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，以確保得到好的測(cè)序結(jié)果。以下

16、圖為例：該反應(yīng)的背景信號(hào)較高，不利于堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴(kuò)增?；蛘呖梢詫⒃揚(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測(cè)序。 Q-2.什么是堿基缺失？ A-2.以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中擴(kuò)增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個(gè)連續(xù)的T解決方法：(1) 使用反向引物繼續(xù)測(cè)序，以矯正缺失位點(diǎn)并達(dá)到測(cè)通的目的?；蛘邔⒃揚(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，挑取單克隆測(cè)序。(2) 如果可以確定該P(yáng)CR片段中不應(yīng)該有缺失的位點(diǎn)，那么可以改變PCR反應(yīng)條件，重新擴(kuò)增。Q-3.什么是引物不純？ A-3.以下圖為例：引物不純?cè)斐梢拼a現(xiàn)象，該種現(xiàn)象與模板雜在峰圖都表現(xiàn)為

17、背景峰較雜，但是引物不純?cè)诜鍒D上表現(xiàn)的更有規(guī)律，一般在每一個(gè)主峰前或者后都有一個(gè)同一堿基的小峰。解決辦法：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測(cè)序。Q-4.重復(fù)結(jié)構(gòu)對(duì)測(cè)序有哪些影響？ A-4.以下圖為例：重復(fù)結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致測(cè)序復(fù)制框的滑移，重復(fù)結(jié)構(gòu)之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該重復(fù)結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q-5.什么是模板不單一？ A-5.以下圖為例：(1) 菌液為非單克?。合聢D是pGEM-T載體測(cè)序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雙峰（插入后雙峰），即模板中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需

18、要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。(2) PCR產(chǎn)物不純，如下圖所示：在197bp前測(cè)序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個(gè)高高的A峰，這個(gè)A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個(gè)片段大小為200bp左右的小片段。注：PCR產(chǎn)物測(cè)序都是以A高峰終止。解決方法：對(duì)PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測(cè)序。Q-6.Poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果是怎樣的？ A-6.以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼、雙峰、套峰現(xiàn)象，而在polyG/C之后會(huì)往往導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)的衰減或者直接中斷。解決辦法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該pol

19、y結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。如果是較長的PloyG/C，建議客戶使用3.0試劑盒進(jìn)行測(cè)序。Q-7.含有回文結(jié)構(gòu)的模板測(cè)序結(jié)果是怎樣的？ A-7.以下圖為例：位點(diǎn)94至137是一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號(hào)衰減，出現(xiàn)錯(cuò)誤的判讀。解決方法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。A-8.測(cè)序峰圖為前雙峰的結(jié)果是什么樣的？ A-8. (1) 產(chǎn)物中含有小片段PCR產(chǎn)物；(2) 引物有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)結(jié)果中斷解決方法：換引物反向測(cè)序。Q-9.測(cè)序峰圖為后雙峰是什么樣的？ A-9.原因和解決方法同回文結(jié)構(gòu)及插入后雙峰。Q-10.無信號(hào)的結(jié)果：信號(hào)值（ATGC

20、的平均值）皆小于100A-10.以下圖為例：測(cè)序無信號(hào)的判定：在確認(rèn)引物、質(zhì)粒抽提濃度、反應(yīng)安排等條件無問題的情況下，測(cè)序結(jié)果峰型雜亂且信號(hào)值小于100的結(jié)果；此時(shí)則判定結(jié)果為測(cè)序無信號(hào)。兩次測(cè)序無信號(hào)，我們會(huì)取消實(shí)驗(yàn)。Q-11.飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時(shí)堿基產(chǎn)生替代而出現(xiàn)堿基位移 A-11.以下圖為例在用特殊試劑盒（3.0）時(shí)，會(huì)發(fā)生堿基替代，從而出現(xiàn)堿基位移的現(xiàn)象，即飄峰。解決方法：用普通試劑盒（3.1）測(cè)序消除堿基位移。注：3.0試劑盒只對(duì)局部高GC有效，對(duì)POlyA/T、重復(fù)結(jié)構(gòu)（GT/GA等）無效，建議先用3.0試劑盒測(cè)序，然后用普通試劑盒進(jìn)行糾正。Q-12.沒有任何干擾的結(jié)

21、果 A-12.DNA 測(cè)序常見問題解答（FAQs）(From : HTUTUUUTTH )DNA 測(cè)序常見問題解答（FAQs）Q1. DNA測(cè)序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測(cè)序儀測(cè)序的準(zhǔn)確度如何？Q2. 為什么在測(cè)序報(bào)告上找不到我的引物序列？ Q3. 我有一個(gè)大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測(cè)通。 Q4. 為什么我的PCR片段為300bp，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？ Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測(cè)序總得不到好的結(jié)果？ Q6. 我進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度對(duì)我的樣品完成測(cè)序反應(yīng)？ Q7. 我的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有多條

22、帶，是否可以為我完成切膠純化，再進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)？哪些情況下需要進(jìn)行切膠純化？ Q8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測(cè)序？ Q9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)條帶單一，為什么測(cè)序結(jié)果說模板雜？ Q10. 什么是堿基缺失？ Q11. 什么是引物不純？ Q12. 重復(fù)結(jié)構(gòu)對(duì)測(cè)序有哪些影響？ Q13. 什么是模板不單一？ Q14. poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果是怎樣的？ Q15. 含有回文結(jié)構(gòu)的模板測(cè)序結(jié)果是怎樣的？Q1. DNA測(cè)序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測(cè)序儀測(cè)序的準(zhǔn)確度如何？答：DNA測(cè)序的原理是末端終止法。具體步驟如下：定量：對(duì)樣品及引物進(jìn)行定量。

23、測(cè)序反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測(cè)序反應(yīng)。讀取數(shù)據(jù)：利用測(cè)序儀讀取被測(cè)樣品的堿基序列。ABI公司目前承諾測(cè)序結(jié)果在800bp以內(nèi)準(zhǔn)確率為98.5%。Q2. 為什么在測(cè)序報(bào)告上找不到我的引物序列？答：1） 如果您提供的是PCR樣品，在測(cè)序報(bào)告上找不到您的引物序列是正常的。這是因?yàn)闇y(cè)序反應(yīng)是通過對(duì)被熒光標(biāo)記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測(cè)序引物由于沒 有熒光標(biāo)記，因此自然在測(cè)序結(jié)果中就不會(huì)被識(shí)別。實(shí)際上不但測(cè)序引物無法識(shí)別，而且由于目前測(cè)序技術(shù)的局限性，緊靠測(cè)序引物一側(cè)的3050個(gè)bp通常也無法100識(shí)別，如果需要驗(yàn)證這個(gè)區(qū)域的堿基序列或者測(cè)

24、序引物本身的序列，就需要用另一側(cè)引物進(jìn)行反向測(cè)序。2 ）您提供的是質(zhì)?；蚓簶悠?使用通用引物測(cè)序，找不到您的PCR引物可能是因?yàn)槟腜CR引物距離載體的通用引物位點(diǎn)過近，由于測(cè)序反應(yīng)在距離起始位點(diǎn)30-50bp內(nèi)的結(jié)果可信度不高，因此會(huì)影響您正確讀取您的PCR引物序列。Q3.我有一個(gè)大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測(cè)通。答：對(duì)于片段較大的PCR樣品我們建議您將其克隆進(jìn)載體后再做測(cè)序。因?yàn)?，一方面PCR產(chǎn)物的純度不是很好掌握，測(cè)序的成功率不如質(zhì)粒和菌液測(cè)序；另一方面，與PCR引物相比，一般載體上的通用引物與模板結(jié)合的能力更強(qiáng)。長度為1Kb的DNA模板需要兩個(gè)測(cè)序反應(yīng)，才有可能得到完整準(zhǔn)確的

25、讀長，對(duì)于1kb以上的DNA片斷，在兩個(gè)反應(yīng)后還需要設(shè)計(jì)合成測(cè)序引物，測(cè)序后拼接出全長，對(duì)于這些測(cè)序引物，我們將按堿基個(gè)數(shù)收取引物合成費(fèi)用。Q4.為什么我的PCR片段為300bp，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？答：如果您查看峰圖的話，可以在您的PCR序列終止處看到一個(gè)高高的A峰，該A峰是您的PCR測(cè)序反應(yīng)的結(jié)束標(biāo)志，在此標(biāo)志之后的序列是噪音，而不是您的測(cè)序結(jié)果。因?yàn)槲夜就耆覍?shí)于測(cè)序結(jié)果，不會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人為修改。所以在您收到結(jié)果時(shí)，請(qǐng)結(jié)合我們的DNA測(cè)序服務(wù)報(bào)告查看測(cè)序峰圖，按照您的實(shí)驗(yàn)要求對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測(cè)序總得不到好的結(jié)果？

26、答：用于測(cè)序的引物比用作PCR反應(yīng)的引物要求高，以下是不適合用于測(cè)序反應(yīng)的引物類型：不純的引物：用于測(cè)序的引物純度要求很高，合成中的小片段會(huì)直接造成嚴(yán)重的背景峰。用于測(cè)序的引物序列長度之所以一般在24個(gè)堿基之內(nèi)，就是因?yàn)檫^長的引物純度不易保證。簡并引物，隨機(jī)引物和有特殊標(biāo)記的引物都不適合DNA測(cè)序。Q6. 我進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度對(duì)我的樣品完成測(cè)序反應(yīng)？答：非常抱歉，目前我公司不會(huì)單獨(dú)對(duì)客戶的測(cè)序反應(yīng)設(shè)定特定的條件，全部的測(cè)序反應(yīng)均在統(tǒng)一的條件下完成。Q7. 我的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有多條帶，是否可以為我完成切膠純化，再進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)？哪些情況下需要進(jìn)行切膠純化。答：

27、目前我公司通常只接收單一條帶的PCR產(chǎn)物，一般不提供切膠純化服務(wù)。如果老師自己實(shí)驗(yàn)室的確無法完成切膠工作，在同意交付25元/條帶的服務(wù)費(fèi)后，我公司可以提供此項(xiàng)服務(wù)。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)以下情況之一時(shí)，建議進(jìn)行切膠純化：1） 除主帶外，還存在其他條帶；2） 引物二聚體在過柱純化后還大量存在，將影響測(cè)序結(jié)果；3）體系中鹽分在過柱純化后還影響測(cè)序結(jié)果。Q8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測(cè)序？答：可以。我公司將免費(fèi)為您進(jìn)行PCR產(chǎn)物的過柱純化，目的在于去除PCR反應(yīng)體系中的大部分小片段、剩余dNTP及大部分的鹽分。Q9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)條帶單一，為什么

28、測(cè)序結(jié)果說模板雜？答：PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)的結(jié)果只是一個(gè)粗略的定性結(jié)果。對(duì)于與目的片段條帶大小只相差幾個(gè)堿基的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是無法用肉眼區(qū)分開的。但是DNA測(cè)序反應(yīng)敏感而客觀，可以直接反應(yīng)出模板本身的情況。需要強(qiáng)調(diào)的是，高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物才可能得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，如果您對(duì)PCR產(chǎn)物的純度不很確定，希望您可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，以確保得到好的測(cè)序結(jié)果。以下圖為例：該反應(yīng)的背景信號(hào)較高，不利于堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴(kuò)增?；蛘呖梢詫⒃揚(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測(cè)序。Q10.什么是堿基缺失？答：以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中

29、擴(kuò)增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個(gè)連續(xù)的T。解決方法：1) 使用反向引物繼續(xù)測(cè)序，以矯正缺失位點(diǎn)并達(dá)到測(cè)通的目的?；蛘邔⒃揚(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，挑取單克隆測(cè)序；2) 如果可以確定該P(yáng)CR片段中不應(yīng)該有缺失的位點(diǎn)，那么可以改變PCR反應(yīng)條件，重新擴(kuò)增。Q11.什么是引物不純？答：以下圖為例：引物不純?cè)斐梢拼a現(xiàn)象，該種現(xiàn)象與模板雜在峰圖都表現(xiàn)為背景峰較雜，但是引物不純?cè)诜鍒D上表現(xiàn)的更有規(guī)律，一般在每一個(gè)主峰前或者后都有一個(gè)同一堿基的小峰。解決方法：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測(cè)序。Q12.重復(fù)結(jié)構(gòu)對(duì)測(cè)序有哪些影響？答：以下圖為例：重復(fù)結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致測(cè)序復(fù)制框的滑移，重復(fù)

30、結(jié)構(gòu)之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該重復(fù)結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q13.什么是模板不單一？答：以下圖為例，下圖是pGEM-T載體測(cè)序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。對(duì)于PCR產(chǎn)物也同樣有模板不單一的情況，如下圖所示：在197bp前測(cè)序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個(gè)高高的A峰，這個(gè)A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個(gè)片段大小為200bp左右的小片段。解決

31、方法：對(duì)PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測(cè)序。Q14. poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果是怎樣的？答：以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會(huì)往往導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)的衰減。解決辦法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q15.含有回文結(jié)構(gòu)的模板測(cè)序結(jié)果是怎樣的？答：以下圖為例：位點(diǎn)94至137是一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號(hào)衰減，出現(xiàn)錯(cuò)誤的判讀。解決方法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。手把手教您看測(cè)序圖(From: HTUTUUUTTH )一般來說，我們只需把測(cè)序序列結(jié)果和原有的

32、目的序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（Blast）就行了，如果序列百分之百吻合，或者所需要的突變點(diǎn)（片段）成功突變或插入片段成功插入，就OVER了。關(guān)鍵是測(cè)序結(jié)果有時(shí)候模憐兩可，需要我們自己來把握，或者說，為我們自己爭取不付費(fèi)的權(quán)利。測(cè)序看圖文件有吧？沒有就下載這個(gè)：點(diǎn)擊瀏覽該文件里面有個(gè)補(bǔ)丁，打一下，就可以永久使用了。測(cè)序結(jié)果文件一般有兩個(gè)，一個(gè)是序列文件，一個(gè)是圖譜文件，圖譜文件用上面的程序可以打開（*.abi.或 *.scf)。序列文件打不開？那您能隨便裝個(gè)什么DNAstar,DNAman或者俺最喜歡用的Genetool，或者裝個(gè)edit（這玩意好啊，一般人沒用過，呵呵）1.安裝好看圖軟件后，雙擊峰圖文

33、件就可以打開，沒有序列文件？那下一個(gè)吧：點(diǎn)擊瀏覽該文件打開峰圖文件，依據(jù)圖形初步判定測(cè)序質(zhì)量，這個(gè)圖一般般，頭峰雜度比較大，至少前50bp序列不可信。2. 既然峰形不錯(cuò)由此初步判定測(cè)序結(jié)果可信，那就來比比測(cè)序結(jié)果與我們預(yù)期的有什么差異吧當(dāng)我們打開圖形文件的時(shí)候，我們也可以輸出測(cè)出來的序列，就是export啦，如下圖，port后能得到文本形式的序列結(jié)果不過俺一般習(xí)慣了用ultra-edit，直接雙擊測(cè)序公司提供的序列文件，它是這樣顯示的：我說，您還是別用了，俺當(dāng)初是用ultra-edit處理一些其它數(shù)據(jù)（當(dāng)然是word/notebook等無法勝任的數(shù)據(jù)）時(shí)，發(fā)現(xiàn)它還可以打開*.seq文件，于是就

34、一直用過來了3.關(guān)于序列比對(duì)，沒有太多好說的吧。假設(shè)原有序列為A文件，測(cè)序結(jié)果為B文件，例如，在DNA工具軟件genetool中打開B，通過調(diào)用工具（上圖），進(jìn)入Blast程序(說這個(gè)是Blast程序有點(diǎn)牽強(qiáng)，其實(shí)是同源性比較，其實(shí)質(zhì)不就是Blast的嘛，哈哈)。加上原序列文件A之后，就直接按align all button啦這個(gè)就是比對(duì)結(jié)果：4、峰圖頭尾測(cè)序結(jié)果的不可靠性：頭尾的問題，很多測(cè)序公司都明確標(biāo)出了頭尾各80-100bp序列的不可靠性，這是測(cè)序起始信號(hào)與終止信號(hào)不穩(wěn)定的體現(xiàn)，就如同一個(gè)跑步一樣，發(fā)力起跑與力衰止跑之時(shí)，速度是不穩(wěn)定的，無法用來衡量其跑步速度但俺見識(shí)過一家測(cè)序公司的測(cè)

35、序結(jié)果，既使是頭尾區(qū)，其結(jié)果也是可信的，但總體測(cè)序長度不夠長，可能是用其它軟件進(jìn)行了掐頭去尾之后移花接木的處理吧！這里要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)的是，有時(shí)候測(cè)序公司給出的是反向測(cè)序結(jié)果，簡單的align得不到匹配結(jié)果，這時(shí)，你千萬不要急著罵測(cè)序公司，試試把測(cè)序結(jié)果reverse 或reverse complement一下再進(jìn)行align，也許會(huì)有預(yù)期的結(jié)果(見過不少這樣的朋友，其實(shí)仍然只能怪我們自己_)5.干擾峰與結(jié)果判讀這個(gè)峰是作出來的，線條有點(diǎn)粗，將就說事。第一個(gè)峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點(diǎn)可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。第二個(gè)峰，錯(cuò)位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預(yù)期多一個(gè)堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。所謂干擾，前提前件是主峰要清晰、連續(xù)，但峰圖中莫名其妙多出一條類似或接近于主峰清晰程度的峰線，但這種峰線往往是不平滑、不連續(xù)的，這是干擾峰判讀的重點(diǎn)！6、SNP的判讀做SNP的人不少，AFLP仍然是一種經(jīng)濟(jì)、適用的方法之一。AFLP的結(jié)果多需要用測(cè)序來進(jìn)行驗(yàn)證，但似乎以測(cè)序來驗(yàn)證結(jié)果的人并不多，或者說驗(yàn)證一二個(gè)樣本就完了，其實(shí)這樣并不科學(xué)，還是多驗(yàn)證幾個(gè)吧，證據(jù)多了，沒人會(huì)說我們少了，但證據(jù)少了，我們自