八棱海棠遺傳多樣性和親緣關(guān)系的TP

1、八棱海棠遺傳多樣性和親緣關(guān)系的TP論文摘要：利用TP-M13-SSR的方法對河北收集的八棱海棠資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究。16對TP-M13-SSR引物對34份材料進(jìn)行擴(kuò)增出205個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)12.8個(gè)等位基因。分析結(jié)果說明，除山荊子、海棠花和綿蘋果外的31份八棱海棠材料的遺傳系數(shù)為0.7879，平均位點(diǎn)雜合度為0.8413，平均多態(tài)性信息含量為0.7592；河北懷來的八棱海棠與海棠花、山荊子的相似系數(shù)高于小礬山和大古城產(chǎn)地，其與山荊子和海棠花的親緣關(guān)系可能要近于后兩者；三塊石海棠1與綿蘋果的相似系數(shù)最高，在起源演化上可能要晚于其他的海棠類型；系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，所有供試

2、材料主要分為兩大類，與起源演化相關(guān)，第一類為野生種海棠花和山荊子，第二類主要為綿蘋果和八棱海棠的各地方類型品種。河北懷來可能是八棱海棠主要的原始起源地區(qū)，與其他地區(qū)相比，小礬山地區(qū)八棱海棠與其親緣更近。論文關(guān)鍵詞：八棱海棠,遺傳多樣性,親緣關(guān)系八棱海棠，又叫懷來海棠，原產(chǎn)于懷來縣，可能是山定子和海棠果的雜交種，有千余年的栽培歷史。其樹體具有結(jié)果早、產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、抗性強(qiáng)和與栽培品種的親和性好等特點(diǎn)；而果實(shí)那么具有果形美、色澤好、含糖量高、耐貯運(yùn)、口味佳等優(yōu)點(diǎn)，既可以生食，也是加工的好原料。因此八棱海棠既可以用作砧木又可以用作水果生產(chǎn)，也因此而成為目前中國應(yīng)用最廣泛的蘋果砧木之一。八棱海棠因是

3、實(shí)生繁殖，其類型很多，如冷海棠、熱磙子、六軸滾海棠、圓海棠、牛媽奶海棠、平頂海棠、熱海棠等，以往對于八棱海棠的研究多注重于提高其抗性以作砧木利用方面，但對于八棱海棠的遺傳多樣性和親緣演化關(guān)系研究甚少。本研究針對河北不同地區(qū)收集的局部八棱海棠資源進(jìn)行TP-M13-SSR的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，旨在為今后八棱海棠資源的進(jìn)一步收集和鑒定評價(jià)提供根底，并為其利用和種質(zhì)開發(fā)等提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料試驗(yàn)材料取自河北懷來、大古城、小礬山、三塊石等八棱海棠的密集分布區(qū)，共計(jì)31份；此外，山定子、海棠果和綿蘋果那么取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家果樹種質(zhì)興城蘋果資源圃。材料名稱及編號見表1。表

4、134份供試蘋果材料Table134materialsforTP-M13-SSRanalysis 編號 code 材料名稱 Material name 學(xué)名 Book name 1 海棠花Haitanghua M.prunifolia(Willd.)Borkhausen 2 綿蘋果Mianpingguo M.domestica Borkh. 3 山荊子Shanjingzi M.baccata(L.)Borkh 4 懷來八棱海棠Huailaibalenghaitang M.robusta Rehd. 5 河北八棱Hebeibaleng M.robusta Rehd. 6 大古城八棱海棠實(shí)生Dag

5、uchengbalenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 7 小礬山八棱Xiaofanshanbaleng M.robusta Rehd. 8 小礬山八棱1號Xiaofanshanbaleng1hao M.robusta Rehd. 9 紫色小礬山八棱Zisexiaofanshanbaleng M.robusta Rehd. 10 小礬山八棱海棠實(shí)生Xiaofanshanbalenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 11 小礬山海棠2號Xiaofanshanhaitang2hao M.robusta Rehd. 12 小礬山海棠2號實(shí)

6、生Xiaofanshanhaitang2haoshisheng M.robusta Rehd. 13 沁源灤莊沙果Qinyuanluanzhuangshaguo M.robusta Rehd. 14 灤莊沙果實(shí)生Luanzhuangshaguoshisheng M.robusta Rehd. 15 平頂海棠Pingdinghaitang M.robusta Rehd. 16 河北平頂海棠實(shí)生Hebeipingdinghaitangshisheng M.robusta Rehd. 17 紅海棠Honghaitang M.robusta Rehd. 18 冷海棠Lenghaitang M.robu

7、sta Rehd. 19 冷海棠實(shí)生Lenghaitangshisheng M.robusta Rehd. 20 小礬山海棠4號Xiaofanshanhaitang4hao M.robusta Rehd. 21 小礬山海棠實(shí)生Xiaofanshanhaitangshisheng M.robusta Rehd. 22 三塊石海棠1號Sankuaishihaitang1hao M.robusta Rehd. 23 三塊石海棠2號Sankuaishihaitang2hao M.robusta Rehd. 24 三塊石海棠1號實(shí)生Sankuaishihaitang1haoshisheng M.robu

8、sta Rehd. 25 三塊石海棠2號實(shí)生Sankuaishihaitang2haoshisheng M.robusta Rehd. 26 短枝磙子Duanzhigunzi M.robusta Rehd. 27 短枝磙子實(shí)生Duanzhigunzishisheng M.robusta Rehd. 28 熱磙子Regunzi M.robusta Rehd. 29 熱磙子實(shí)生Regunzishisheng M.robusta Rehd. 30 光面磙子實(shí)生Guangmiangunzishisheng M.robusta Rehd. 31 早白海棠Zaobaihaitang M.robusta R

9、ehd. 32 晚白海棠Wanbaihaitang M.robusta Rehd. 33 晚白海棠實(shí)生Wanbaihaitangshisheng M.robusta Rehd. 34 玲鐺果Lingdangguo M.robusta Rehd. 1.2實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)處理采用德國QIAGEN的DNeasyPlantMiniKit提取供試材料的基因組DNA。本實(shí)驗(yàn)選用的30對普通的SSR引物序列均來源于Yamamoto等、R.Liebhard等報(bào)道的序列，TP-M13-SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)效勞合成，5端帶有熒光標(biāo)記的M13正向引物 Primer Sequence M13-B 6FAMT

10、M 56FAMTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 M13-G VICTM 5VICTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 M13-Y NEDTM 5NEDTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 參照Schuelke Forward Primer Sequence 反向引物序列 Reverse Primer Sequence 退火溫度 Annealing temperature () KA4b F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-AAA GGT CTC TCT CAC TGT CT R:CCT CAG CC

11、C AAC TCA AAG CC 48 BGT23b F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAC ATT CAA AGA TTA AGA T R:ACT CAG CCT TTT TTT CCC AC 50 CH01f03b F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAG AAG CAA ATG CAA AAC CC R:CTC CCC GGC TCC TAT TCT AC 58 CH02b121 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGC AGG CTT TAC GAT TAT GC R:CCC ACT AAA AGT TCA CAG

12、 GC 59 CH03d07 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAA ATC AAT GCA AAA CTG TCA R:GGC TTC TGG CCA TGA TTT TA 51 CH04e03 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TTG AAG ATG TTT GGC TGT GC R:TGC ATG TCT GTC TCC TCC AT 60 CH04h02 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGA AGC TGC ATG ATG AGA CC R:CTC AAG GAT TTC ATG CCC AC 55.5 CH

13、05c06 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ATT GGA ACT CTC CGT ATT GTG C R:ATC AAC AGT AGT GGT AGC CGG T 58 CH05d08 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TCA TGG ATG GGA AAA AGA GG R:TGA TTG CCA CAT GTC AGT GTT 55.5 CH02a04 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAA ACA GGC GCC ATT ATT TG R:AAA GGA GAC GTT GCA AGT GG 58 CH05b

14、06 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACA AGC AAA CCT AAT ACC ACC G R:GAG ACT GGA AGA GTT GCA GAG G 55 CH05d04 F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACT TGT GAG CCG TGA GAG GT R:TCC GAA GGT ATG CTT CGA TT 60 CH01f07a F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA CAC AGT TTC TCA ACC C R:CGT TTT TGG AGC GTA GGA AC 59 CH04g07 F:

15、CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA ACC TCA ATC CCC AAT R:ATG AGG CAG GTG AAG AAG GA 57 CH05e04 F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CAA GGA GAA GAC CGT GTG AAA TC R:CAT GGA TAA GGC ATA GTC AGG A 57 CH05h12 F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CTT GCG GAG TAG GTT TGC TTT R:TCA ATC CTC ATC TGT GCC AA 60 2.2品種鑒定和遺傳多樣性分析表416個(gè)SS

16、R位點(diǎn)在31份八棱海棠資源上檢測到的遺傳多樣性Table4Geneticdiversityof31cultivarsofMalusrobustaRehd.revealedby16SSRprimers 標(biāo)記 Marker 主等位基因頻率 基因型數(shù)Genotype No. 等位基因數(shù)Allele No. 基因多樣性 Gene Diversity 雜合度Heterozygosity 多態(tài)性信息含量PIC KA4b 0.4138 9 5 0.7063 0.4138 0.6589 BGT23b 0.5161 3 2 0.4995 0.7097 0.3747 CH01f03b 0.3387 13 7 0.

17、7784 0.9355 0.7468 CH02b12 0.2258 19 12 0.8512 0.8065 0.8349 CH03d07 0.4516 13 12 0.7279 0.9677 0.6975 CH04e03 0.2097 20 15 0.8720 0.9355 0.8595 CH04h02 0.2167 22 17 0.8856 0.9667 0.8758 CH05c06 0.3103 17 15 0.8199 0.9655 0.7998 CH05d08 0.2742 15 11 0.8137 0.7419 0.7892 CH02a04 0.3548 16 13 0.7981 0

18、.8710 0.7755 CH05b06 0.3226 17 20 0.8377 0.9677 0.8233 CH05d04 0.4516 14 12 0.7409 0.8387 0.7168 CH01f07a 0.2321 19 15 0.875 0.8571 0.8636 CH04g07 0.2903 18 14 0.8304 0.8065 0.8118 CH05e04 0.2581 19 14 0.8632 0.7742 0.8499 CH05h12 0.4516 11 9 0.7076 0.9032 0.6694 平均 Average 0.3324 15.3 12.1 0.7880 0

19、.8413 0.7592 圖1TP-M13-SSR所檢測的蘋果不同品種在SSR位點(diǎn)CH01f03b的指紋圖譜Chart1ThefingerprintingrevealedbyTP-M13-SSRindifferentapplecultivarsatCH01f03b2.3親緣與聚類分析收集的八棱海棠的野生資源經(jīng)實(shí)生繁殖后變異極明顯，例如：小礬山八棱海棠與小礬山八棱海棠實(shí)生的相似系數(shù)為0.8098，冷海棠和冷海棠實(shí)生的相似系數(shù)為0.7610，三塊石海棠1與三塊石海棠1實(shí)生相似系數(shù)為0.7268。根據(jù)16對引物的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，對所有供試的34份材料，以Dice相似系數(shù)采用UPGMA聚類見圖2，在相似系數(shù)

20、0.77處將所有供試材料主要分為兩大類，與起源演化相關(guān)。第一類為野生種海棠花和山荊子；第二類主要為八棱海棠的各海棠品種，其又包含三個(gè)小類。第一小類主要為綿蘋果、三塊石海棠、晚白海棠以及八棱海棠的各地方類型，其應(yīng)是最接近于栽培品種；第二小類主要為冷海棠、熱磙子、紅海棠和早白海棠，其在演化上可能要先于第一小類，而其中又以紅海棠與熱磙子相似系數(shù)最高；第三小類主要為懷來八棱、小礬山八棱、小礬山檳子、三塊石海棠2和鈴鐺果，其在演化上可能又要先于第二小類。河北懷來可能是八棱海棠主要的原始起源地區(qū)，與其他地區(qū)相比，小礬山地區(qū)八棱海棠與其親緣更近。圖2八棱海棠、山定子、海棠果和綿蘋果的聚類分析樹狀圖3討論TP

21、-M13-SSR的方法是基于熒光測序技術(shù)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測體系，通過普通的SSR引物與M13熒光引物的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的快速檢測，準(zhǔn)確獲得不同SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，使機(jī)器自動收集、分析數(shù)據(jù)代替了銀染方法的人工讀取膠板的繁瑣工作，在很大程度上降低了系統(tǒng)誤差。其在玉米和高粱等作物中已經(jīng)得到很好的應(yīng)用，在本實(shí)驗(yàn)中的成功應(yīng)用也證明其可以應(yīng)用到蘋果種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究中。本實(shí)驗(yàn)中紫色小礬山八棱和小礬山海棠4的結(jié)果完全相同，可能是由于兩者的差異極小，利用現(xiàn)有的16個(gè)SSR檢測位點(diǎn)缺乏以檢測出兩者的差異，因此，如要僅以揭示兩者的差異，需進(jìn)一步增加SSR檢測位點(diǎn)的量。此外，引

22、物KA4b和BGT23b為梨SSR引物，其在本實(shí)驗(yàn)的研究中也得到了很好的應(yīng)用，證明了在TP-M13-SSR的技術(shù)體系中蘋果和梨的SSR引物具有很好的通用性，進(jìn)一步地吻合了SSR引物在薔薇科內(nèi)具有一定的通用性的結(jié)論。河北懷來的八棱海棠與海棠花和山荊子的相似系數(shù)最高，均高于小礬山和大古城等地的八棱海棠與海棠花和山荊子，其與山荊子和海棠花的親緣關(guān)系可能要近于后兩者。山西、河北300多年前是蘋果栽培種中，中國蘋果即綿蘋果的最適分布區(qū)，華北曾形成綿蘋果的次生中心，而三塊石海棠1與綿蘋果的相似系數(shù)最高，在起源演化上可能要晚于其他的海棠類型。河北懷來可能是八棱海棠主要的原始起源地區(qū)，與其他地區(qū)相比，小礬山地

23、區(qū)八棱海棠與其親緣更近。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過TP-M13-SSR檢測，所有原生境收集的八棱海棠野生資源經(jīng)過實(shí)生繁殖后成活的植株均較原株有較大變異。因此，要收集和保存野生八棱海棠蘋果資源，最好采用嫁接的方法進(jìn)行繁殖保存。假設(shè)采用實(shí)生繁殖的方法，多大的遺傳群體可以最大限度的保持野生原株的遺傳完整性是急需要解決的問題。八棱海棠的實(shí)生變異明顯加之自然雜交融合，經(jīng)過復(fù)雜的繁衍和演化，形成了河北八棱海棠的復(fù)雜分布和系譜，研究和保持其遺傳多樣性并對其加以利用將具有重要的意義。從分子角度為八棱海棠的起源和演化過程提供一定的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)1 CHEN Jing-xin. Apple topography of He

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