2015研究生實驗6不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、2015 級研究生分子生物學技術實驗五 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳【要求】熟悉血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的特點，了解操作過程和注意事項。實驗分組（每人做一管，每4人配一份膠）認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）封管分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學聚合，每組總體積為10ml，灌膠高度為78cm）封正丁醇3mm（注意避免沖擊凝膠液面,約15min膠聚合）P138：濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，每組總體積為4ml，灌膠高度為1.5cm,留1cm空加樣）倒掉并用濾紙條吸干正丁醇后，灌濃縮膠封正丁醇3mm（觀察界面的形成，判斷凝固時間）安裝電泳槽，加buffer （注意電流及電極的方向、不漏水、

2、除氣泡）樣品處理并加樣（20ul）電泳（濃縮膠時3mA/管，分離膠時2mA/管，距底1cm時停止）剝膠：取下凝膠管，用帶10cm長針頭的注射器吸滿蒸鎦水。將針頭小心插入膠柱與管壁之間，邊注水，邊旋轉玻管，靠水流壓力和潤滑力將玻管內壁與凝膠分開，然后用洗耳球在膠管一端輕輕加壓，凝膠柱便緩緩從玻管中滑出。 固定（時間5min）染色（時間2min）漂洗脫色至背景透亮注意事項1Acr和Bis是神經毒劑，應避免與皮膚接觸。Acr和Bis在低溫下穩(wěn)定，應放棕色瓶干燥低溫（4）保存。30單體交聯(lián)劑應裝棕色瓶中，可于冰箱（4）貯存12月。如pH值超出4.95.2，則表明該試劑已失效，失效液不能聚合。TEMED

3、宜密封避光保存。制備凝膠用玻管要用洗液浸泡清潔，否則由于玻管不清潔，倒膠后在管壁會出氣泡。制備分離膠和濃縮膠時，加入催化劑和加速劑混合后約在1030分鐘內聚合，應盡快注入玻管。如室溫過高時，為防止過快聚合，可放置冰浴中操作。如果凝膠不聚合，通常是由于制備的試劑濃度不準確，或者凝膠混合液中漏加某一試劑，也可能是試劑不純所致，應重新配制混合液。 二、電泳基本原理及相關知識 電泳的概念 帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質中向與其電荷性質相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象。 廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質分類） 紙電泳 醋酸纖維膜電泳 凝膠電泳 瓊脂

4、糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳的基本原理利用物質的兩個差異來分離物質電荷差異 電荷性質 電荷數量分子差異 分子大小 分子形狀 電泳分離蛋白質的原理 蛋白質兩性解離與等電點 溶液pH與蛋白質PI決定蛋白質 電荷性質與數量 不同蛋白質分子大小和分子形狀 的差異 電泳的影響因素 帶電粒子的性質 電場強度 溶液的pH 溶液的離子強度 電滲現(xiàn)象 環(huán)境因素 三、聚丙烯酰胺凝膠電泳 【原理】聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺通過化學催化或光催化聚合形成的三維空間的聚合物。它應用于電泳具有以下特點：分子篩作用，樣品分離效果好；通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的相對比例來調節(jié)凝膠的孔徑，以分離不同大

5、小的蛋白分子；凝膠不帶電荷，幾乎無電滲作用；化學穩(wěn)定性高；有彈性，機械強度好。 合成聚丙烯酰胺凝膠的兩種方法 化學合成系統(tǒng) 過硫酸銨（AP） 四甲基乙二胺（TEMED） 光學合成系統(tǒng) 核黃素 四甲基乙二胺（TEMED） 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質的原理 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電 泳的三個不連續(xù) 聚丙烯酰胺凝膠電泳的三 個效應 凝膠孔徑不同緩沖液pH不同緩沖液離子成分不同濃縮效應電荷效應分子篩效應Gly -Pro -Cl- Gly -Pro -Cl- Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -Gly -Gly -Gly -pH為8.9的電泳緩沖液（Tris-Gly）pH為6.7的濃縮膠pH為8.3的分離膠有效泳動率：MCl- M Pro- M Gly-6%膠3%膠四、實驗結果的分析 相關理論表-1 血清中各蛋白質的相關特性種 類分子量(萬）PI分 布(%)清蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白