高效液相色譜儀使用

1、關于高效液相色譜儀的使用第一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、概述色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年提出。分離出胡蘿卜素、葉綠素和葉黃素。因一戰(zhàn)爆發(fā)并未重視。第二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱固定相流動相色譜法第三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜的發(fā)展20世紀70年代高效液相色譜出現(xiàn)1906色譜法發(fā)明20世紀50年代氣相色譜出現(xiàn)并廣泛使用19世紀中葉人們開始注意一些簡單的擴散現(xiàn)象 染料目前HPLC已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段第四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜的類型氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：

2、流動相是液相色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高效液相色譜HPLC氣相色譜第五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1.HPLC與經(jīng)典LC HPLC比起經(jīng)典LC的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢，流動相速度為30mlh-1，需用20h才能分離出20種氨基酸；而HPLC配備了高壓輸液設備，流速最高可達 10mlmin-1，只需l h之內即可完成氨基酸的分離。第六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月高效：固定相具有分離效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分

3、。高靈敏度：高靈敏度檢測器，可檢測M級甚至nM級別的待測物。高自動化：操作自動化，可儀器控制流動相比例、流速、波長、出峰時間、進樣及自動生成分析報告等。第七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2. HPLC與GC （l）氣相色譜法(GC)分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20。對于占有機物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用HPLC進行分離和分析。 （2)GC中流動相是惰性氣體，它與組分沒有親和力，僅起運載作用。而HPLC中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流

4、動相對分離起很大作用。 （3）GC一般都在較高溫度下進行的，而HPLC可在室溫條件下工作。第八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC應用 （1）生命化學：蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、酶、維生素等物質的分離和測定； （2）化學與精細化工：植物色素、高聚物、染料、化工產(chǎn)品、合成化合物等的分離和分析；無機離子的測定等； （3）農(nóng)業(yè)、食品與醫(yī)藥學：添加劑（甜味劑、防腐劑、著色劑）、營養(yǎng)成分（蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸等）、藥物體液中代謝物測定；藥代動力學研究；臨床藥物、農(nóng)藥殘留等； （4）環(huán)境分析與毒理學：多環(huán)芳烴及農(nóng)藥殘留、DNA加合物分析。 優(yōu)點是靈敏度高，分離

5、效果好；缺點是儀器設備費用昂貴，需摸索分析方法，操作嚴格，這是它的主要缺點。 第九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、液液色譜法的分類液液色譜法按固定相和流動相的 極性不同可分為：正相色譜法反相色譜法第十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月正相色譜法固定相極性大于流動相。采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃等以調節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。第十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 反相色譜法固定相極性小于流動相

6、。一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。它在液相色譜中應用最為廣泛，占整個HPLC應用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。第十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、色譜法的分離原理分離原理樣本組分進樣到色譜柱上時，會與固定相發(fā)生作用，包括吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等作用。當流動相洗脫色譜柱時，由于各組分與固定相作用的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，和固定相結合弱的組分先

7、出來，結合強的后出來，不同組分會先后從固定相中流出，一個物質會形成一個色譜峰。色譜法由于能分離許多物質，被稱為分離的巨人。第十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。 色譜峰保留時間（分）基線峰高峰寬響應值第十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月基本術語色譜圖(chromatogram)樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線?；€(base line)在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應信號的曲線。噪音(noise)基線信

8、號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。第十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線。不對稱色譜峰有兩種：前延峰和拖尾峰。前者少見，可能是柱子出問題。第十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月保留時間(retention time，tR)組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。理論塔

9、板數(shù)(theoretical plate number，N)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。 當色譜柱長度一定時，塔板數(shù) N越大，被測組分在柱內被分配的次數(shù)越多，柱效能越高，所得色譜峰越窄。第十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月峰高(peak height，h)峰的最高點至峰底的距離。峰面積(peak area，A)峰與峰底之間的面積,又稱響應值。精密度日間、日內精密度準確度加標回收率 值為（加標樣的量樣品量）100% 標品的量標準曲線第十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月定性定量分析及色譜圖標準品-保留時間9.3min標準物質確定物質保留時間定性第二十張，PPT

10、共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜法定性定量分析1.根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析。2.根據(jù)色譜峰的面積或峰高, 可以進行定量分析。3.實驗過程（1）確定實驗條件（流動相、流速、檢測波長等）。（2）溶液的配制：流動相、標準品和待測樣品。（3）精密度和準確度實驗。（4）標準曲線測定。（5）樣品測定。第二十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜分析用水（1）專門的超純水機,得到Milli-Q水；（2） 去離子水重蒸；（3） 二次或三次重蒸水；（4） 采用類似家用的純水機；（5） 市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水。 不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水。 理想的HPLC用水應為18.2

11、的超純水，并通過0.22m的濾膜，除去有機物、無機離子及空氣等。第二十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫箱等。目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京普析分析儀器廠等。四、儀器組成第二十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第二十四張，PPT

12、共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月島津公司LC-20第二十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Agilent 公司 1200 LC 第二十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 為什么要用高壓輸液系統(tǒng)？由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質量和分析結果的可靠性。一元、二元、四元泵。HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。1.輸液泵 第二十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月輸液泵的主要性能流速穩(wěn)定：如1ml/

13、min,其RSD應0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；流速量范圍寬：分析型應在0.110 ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100 ml/min；輸出壓力高：一般應能達到25MPa 或400巴;密封性能好，耐腐蝕。第二十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔，盡量帶進避免顆粒物質，造成泵內堵塞；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下，以免產(chǎn)生結晶； 泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液； 輸液泵的工作壓

14、力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液；流動相應該先脫氣，以免在泵內產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。 第二十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.進樣器2種方法：（1）一般常用六通進樣閥?？捎梦⒘孔⑸淦骰蚨凯h(huán)進樣。前者要求每次進樣體積準確、相同。后者進樣量應大于定量環(huán)體積的36倍，這樣才能完全置換定量環(huán)內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。（2）自動進樣用于大量樣品的常規(guī)分析。 第三十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月六通閥進樣演示第三十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 色譜柱擔負分離作用，是

15、色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子。一般1030cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。第三十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱由柱管、柱接頭、篩板（濾片）、堵頭和螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 常規(guī)分析的色譜柱有內徑25mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長1030cm。 第三十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱使用注意事項柱子在任何情況下不能碰撞

16、、彎曲或強烈震動；選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；第三十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月進樣樣品要提純，避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理；在色譜柱前加預柱或保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保護、延長柱壽命的作用，可更換。每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結束后，都要用清洗柱；第三十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑如甲醇保存，擰緊柱接頭，防止溶劑揮發(fā)干燥。新柱不用是可放時間長些。柱壓升

17、高的原因有樣品和流動相有雜質或顆粒、緩沖液鹽結晶使柱子堵塞、體系不平衡等。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。第三十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月溶劑和樣品過濾對色譜柱、儀器起到保護作用。對色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。對儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。第三十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 檢測器檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變?yōu)殡娦盘?。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界

18、變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。檢測器的類型有紫外可見光、熒光、電化學、電導、放射性檢測器等。第三十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月性能指標（1）噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。（2）靈敏度：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。（3）檢測限（LOD）：試樣中被測物能被檢測到的最低量，以信噪比接近為3:1時的相應濃度作為檢測限。以信噪比接近為10:1時的相應濃度作為定量限（LOQ）第三十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）線性范圍：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍。檢測器所產(chǎn)生的信號與被測樣品的量呈一定的函數(shù)關系作為依

19、據(jù)。線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些。 第四十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.色譜工作站色譜工作站主要有電腦、信號記錄系統(tǒng)和分析軟件。不同的色譜工作站在處理數(shù)據(jù)時情況不同，但目前大多是記錄儀記錄檢測信號，使用積分儀計算峰高、峰面積和保留時間等參數(shù)。好的工作站除能采集、處理和分析數(shù)據(jù)外，還能控制儀器操作，對色譜系統(tǒng)進行優(yōu)化。第四十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月6.柱溫箱色譜柱和檢測器都要求能準確地控制工作環(huán)境溫度，恒溫精度要求在0.10.5之間。溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動

20、相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。 溫度對保留時間有影響。要根據(jù)色譜柱說明書上要求的最適宜溫度設置柱溫箱的溫度。第四十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月7.超聲脫氣 流動相必須預先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起猝滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。 一般流動相溶液需超聲2030mi

21、n。這種離線脫氣不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中，在14小時內，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。在線（系統(tǒng)內）脫氣法無此缺點。第四十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月8. 燈的保養(yǎng)熒光分析用的是氙燈，5000元左右，壽命在800小時左右。因此在色譜柱平衡得差不多、要開始分析時，再打開檢測器熒光燈；在分析完成后，馬上關閉氙燈。第四十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、儀器分析過程與操作1. 流動相的貯存： 一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染，造成柱效降低。貯

22、存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。第四十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 流動相比例調整： 按經(jīng)驗，主峰一般應調至保留時間為615分鐘為宜。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現(xiàn)性更不容易達到，請注意充分平衡柱。流動相組成、pH、比例摸好后，即按此條件測定樣品

23、。流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。第四十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3樣品配制：玻璃容器必須洗凈，酸泡處理后使用，盡量少用或不用塑料容器。HPLC應用中要求用超純水或純凈水或三蒸水配置樣品。樣品配制應嚴格按照方法要求的步驟進行。樣品配制同時還需配制標準樣品，用于標準曲線的測定和目的峰的確定。第四十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如50min-60min），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確

24、定是否會影響主峰的測定。第四十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 進樣量：應注意進樣量要準確、一致。20微升或10微升可由預實驗或標準方法確定。 6. 確定目的峰的保留時間。7. 繪制標準曲線。8. 測定精密度和準確度。9. 樣品測定。10. 分析數(shù)據(jù)。第四十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Agilent 1200 LC操作步驟開機及分析（1）把流動相放入溶劑瓶中，用超聲波脫氣20min，放置20-30min后使用。 （2）打開 1200 LC 脫氣裝置、泵、檢測器及工作站電源。（3）打開電腦,進入在線分析系統(tǒng)。 （4）打開控制異丙醇流速的閥，用注射器抽氣，直到液體流出，控制流速。第五十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）排氣：打開“Purge”閥(往左扭松)，點擊“泵