植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)

1、 植物組織培養(yǎng)的 理論基礎(chǔ) 第一節(jié) 植物細(xì)胞的全能性一、細(xì)胞全能性的概念 任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，即細(xì)胞具有全能性。 細(xì)胞全能性概念隨著實(shí)踐的發(fā)展逐步完善。 1934年，White首次定義為: 每個(gè)植物活細(xì)胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 20世紀(jì)70年代，擴(kuò)大了以上定義范圍，為：植物活細(xì)胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 目前細(xì)胞全能性定義為：每個(gè)植物活細(xì)胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。 應(yīng)激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)的特征。 生物體的生

2、存離不開(kāi)環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災(zāi)、高溫、低溫、昆蟲(chóng)侵害等等。 生物體具有“某種機(jī)制”來(lái)感知和正確估計(jì)環(huán)境的變化，以便在體內(nèi)加以校正，保證體內(nèi)平衡，來(lái)應(yīng)付突變的環(huán)境。如有植物種子休眠期很長(zhǎng)，可以避開(kāi)旱、澇、冷、熱等惡劣環(huán)境（如：500年前蓮子發(fā)芽,沙漠綠洲）。有的植物對(duì)蟲(chóng)蛀有應(yīng)激反應(yīng)，蟲(chóng)蛀后，非但不減產(chǎn)，甚至還能增產(chǎn)。變色龍的變色、壁虎的尾巴等等。 自我復(fù)制： 是指生物體利用自身作模板，通過(guò)代謝作用，復(fù)制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。 “遺傳”保證了物種的純化，“變異”為物種

3、的進(jìn)化提供依據(jù)。 自我復(fù)制實(shí)現(xiàn)了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一。 自我復(fù)制方式因繁殖方式不同而不同。無(wú)性繁殖植物通過(guò)體細(xì)胞分裂即可實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制。 有性繁殖植物自我復(fù)制必須通過(guò)配子體世代和孢子體世代，即： 受精卵 組織分化、器官形成 性成熟 配子 合子（受精卵）減數(shù)分裂細(xì)胞分裂精子卵子 二、離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生 命特性（一）培養(yǎng)細(xì)胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細(xì)胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細(xì)胞具有光自養(yǎng)能力；固氮植物細(xì)胞具有固氮特性；培養(yǎng)細(xì)胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。（二）應(yīng)激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細(xì)胞具有應(yīng)激性，表現(xiàn)在： 非綠色細(xì)胞應(yīng)變出對(duì)培養(yǎng)和環(huán)境的對(duì)應(yīng)方式，以異養(yǎng)

4、方式生存并發(fā)展。依靠培養(yǎng)基供給營(yíng)養(yǎng)來(lái)生存。 植物組織切割損傷后，應(yīng)激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。（三）培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)自體復(fù)制特性 脫分化 植物組織 愈傷組織 （脫分化細(xì)胞） 再分化 植株 脫分化 細(xì)胞、原生質(zhì)體 再分化愈傷組織 植株 細(xì)胞分裂 原生質(zhì)體融合愈傷組織 再分化 植株以上實(shí)例證明： 細(xì)胞分裂以及植株再生展現(xiàn)了培養(yǎng)細(xì)胞自體復(fù)制的特征屬性。 第二節(jié) 脫分化與再分化 脫分化：具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成沒(méi)有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為脫分化。（如根、莖、葉） 再分化：是指離體培養(yǎng)物可以由脫分化狀態(tài)再度分化。包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化遞進(jìn)地進(jìn)行，最后再生

5、完整植株。一、外植體脫分化 如莖段、根段、葉柄段、葉片、花藥、花粉、幼胚等。（一）誘導(dǎo)期間的細(xì)胞生物學(xué)變化 植物組織從母體上切割下來(lái)后，會(huì)發(fā)生一系列細(xì)胞學(xué)及生物化學(xué)方面的變化。 1）細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：細(xì)胞核形狀及外表變化，染色體的凝集，線粒體外形及數(shù)量改變等等。 2）代謝及生化變化：氣體交換率增加，核糖體出現(xiàn)，有關(guān)酶的增加等。（二）與脫分化有關(guān)的因子及其作用 任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，即細(xì)胞具有全能性。這種植物所具有的全能性只是一種可能性。細(xì)胞全能性所需要的條件：離體損傷刺激；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及激素的刺激；培養(yǎng)溫度、光照等的影響。 離體損傷刺激 要使植物組

6、織或細(xì)胞經(jīng)脫分化再生植株，必須從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來(lái)，即處于離體條件 (正常植株葉片上不會(huì)再長(zhǎng)植株或愈傷組織)。離體損傷刺激是細(xì)胞脫分化的重要條件之一。 損傷刺激會(huì)使細(xì)胞呼吸速度增大，稱(chēng)為“損傷呼吸”，酶的活性增加，代謝物含量變化。生長(zhǎng)物質(zhì)的影響 細(xì)胞離體后，以異養(yǎng)方式生存，所以必須給與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（培養(yǎng)基）。另外，還必須給與激素刺激，以打破抑制力，恢復(fù)細(xì)胞分裂。 抑制假說(shuō)：認(rèn)為靜止細(xì)胞仍然保存著在分生組織狀態(tài)時(shí)的那種細(xì)胞分裂潛能，只不過(guò)存在一種抑制物質(zhì)或抑制力，使細(xì)胞分裂能力不能表現(xiàn)。如果去除這種抑制，細(xì)胞就恢復(fù)到分裂狀態(tài)。 這種抑制劑的作用原理及作用位點(diǎn)尚不清楚，但其抑制效能可

7、能會(huì)在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）的作用下而失掉，從而使細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，實(shí)現(xiàn)脫分化。 不同植物細(xì)胞內(nèi)，抑制劑的質(zhì)和量可能是不同的。因此，在組織培養(yǎng)中，往往因植物不同，培養(yǎng)基中添加激素的種類(lèi)和濃度以及配比也不同。培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性 在組織培養(yǎng)中，往往某一部分細(xì)胞能脫分化，而其它細(xì)胞則不能，表現(xiàn)為異質(zhì)性。光照和溫度的影響 各種植物對(duì)光照和溫度的要求不同。 有的植物需要在黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織；但也有的植物在光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織，其植株再生率更高。 對(duì)溫度的要求，往往耐高溫植物或起源熱帶植物，所需培養(yǎng)溫度較高（如甘薯）；而耐低溫植物，培養(yǎng)溫度較低。一般植物培養(yǎng)溫度在25左右。 二、愈傷組織的生長(zhǎng) 經(jīng)脫分化

8、 導(dǎo)致 細(xì)胞具備了分裂能力 結(jié)果細(xì)胞不斷增殖愈傷組織的生長(zhǎng)愈傷組織的生長(zhǎng)1 誘導(dǎo)期 外植體細(xì)胞進(jìn)行分裂準(zhǔn)備的時(shí)期。 外植體細(xì)胞外形沒(méi)多大變化，但細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯增大。愈傷組織的生長(zhǎng)2 分裂期 外植體細(xì)胞開(kāi)始迅速分裂，但外植體中間部分不分裂。 細(xì)胞分裂高峰期的標(biāo)志：細(xì)胞體積最小，細(xì)胞核和核仁最大，細(xì)胞內(nèi)無(wú)大液泡，RNA含量最高。愈傷組織的生長(zhǎng)3 形成期 指外植體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無(wú)序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。 細(xì)胞分裂由原來(lái)局限在外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部的較深層局部分裂。 平周分裂（橫向分裂）：使細(xì)胞層數(shù)增多，組織加厚。 垂周分裂（徑向分裂）：使同

9、一層細(xì)胞數(shù)量增多，使表面積增大。 愈傷組織的生長(zhǎng)并非一致進(jìn)行，待細(xì)胞分裂到一定時(shí)期，便會(huì)停止分裂。但如果把處在旺盛生長(zhǎng)且未分化的愈傷組織切成小塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可維持其活躍生長(zhǎng)。利用此特點(diǎn)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可大量增殖。 也有例外，有的情況下，組織細(xì)胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細(xì)胞上直接再分化器官。優(yōu)良愈傷組織一般應(yīng)具備的條件：1 旺盛的自我增殖能力，以便于用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無(wú)性系。2 容易散碎，以便于用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要的時(shí)候能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。3 高度的胚性或再分化能力，以便于從這些愈傷組織得到再生植株。4 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)而不喪失

10、胚性，以便于可能對(duì)他們進(jìn)行各種遺傳操作。為達(dá)到以上目的，誘導(dǎo)愈傷組織 采取的策略1 選擇合適的基因型和適當(dāng)?shù)耐庵搀w2 選擇合適的培養(yǎng)基3 采用某些特殊的理化因素改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 例子：玉米幼胚愈傷培養(yǎng)，5mg/L硝酸銀，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。根據(jù)對(duì)一些禾谷類(lèi)植物體細(xì)胞愈傷研究，將愈傷分3個(gè)類(lèi)型：1 結(jié)構(gòu)致密，生長(zhǎng)較慢，容易分化成苗，稱(chēng)為保守分裂型2 結(jié)構(gòu)松脆，生長(zhǎng)旺盛，色澤鮮艷，增殖較快，稱(chēng)為亢進(jìn)分裂型 3 結(jié)構(gòu)疏松，生長(zhǎng)緩慢，色澤暗淡，稱(chēng)為衰敗型。三、細(xì)胞分化和組織分化 （一）細(xì)胞分化及其影響因素 細(xì)胞分裂分化成什么樣的細(xì)胞，是擬分生組織細(xì)胞，還是維管組織細(xì)胞，或是其它細(xì)胞?

11、影響細(xì)胞分化的因素： 1.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（激素）。培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等的種類(lèi)、濃度及配比。2.培養(yǎng)基種類(lèi)（營(yíng)養(yǎng)成分）3.糖類(lèi)物質(zhì)。例如培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度，過(guò)低、過(guò)高都不利，一般在2.5%3%比較適宜。4. 其它理化因子。如光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值等。 （二）組織分化 在細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，可以分化出各種各樣的組織。其中，擬分生組織和維管組織是兩種重要的組織。是形成不定芽和不定根的基礎(chǔ)。 擬分生組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類(lèi)似分生組織的細(xì)胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的一團(tuán)小型、薄壁、液泡小的細(xì)胞組織。也叫做生長(zhǎng)中心或分生組織結(jié)節(jié)。 擬分生組織可以從一個(gè)

12、細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞形成，可以起源于愈傷組織的表面，也可以起源于組織內(nèi)部。 在擬分生組織形成的同時(shí)或稍后，愈傷組織中會(huì)分化出維管組織結(jié)節(jié)。 維管組織結(jié)節(jié)：是指一個(gè)區(qū)域的愈傷組織轉(zhuǎn)化為韌皮分子和木質(zhì)分子的混合結(jié)構(gòu)（類(lèi)似形成層）。 這種形成層狀的細(xì)胞向外延伸與擬分生組織連接，形成芽原基或根原基。 四、器官分化和植株形成 脫分化組織（細(xì)胞）形成愈傷組織細(xì)胞分化組織分化（擬分生 組織和維管組織節(jié)結(jié)）器官分化（芽和根）植株形成 （一）、器官分化 器官分化主要指根和芽的分化。是否能夠發(fā)生器官分化，與前培養(yǎng)有關(guān)，如脫分化、細(xì)胞分化、組織分化等。有了前邊這些分化才會(huì)有器官分化。影響器官分化的因素：1 培養(yǎng)基中添加激

13、素的種類(lèi)、濃度及其配比。這是最主要的影響因素。（具體后述）2 培養(yǎng)基中添加其它成分，如水解蛋白、嘌呤類(lèi)、嘧啶類(lèi)、氨基酸等。3 物理因素。如培養(yǎng)溫度、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度等（二）、完整植株的形成植株再生途徑： 器官分化途徑 體胚分化途徑 器官分化途徑： 1 先分化芽，等芽伸長(zhǎng)后在其幼莖基部長(zhǎng)根，形成完整小植株2 先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽而形成完整植株3 在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后二者的維管組織互相連接，成為小植株。 除上述之外，還有兩種情況，不經(jīng)脫分化而直接長(zhǎng)成植株： 直接伸長(zhǎng)莖尖培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株 發(fā)育幼胚培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株五、體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somatic embryonenesis） 在組織培養(yǎng)中，起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。 體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)期單細(xì)胞 小細(xì)胞團(tuán) 球形期 魚(yú)雷形期 心形期 體細(xì)胞胚（Somatic