中性pH條件下化能異養(yǎng)硝酸鹽還原菌對亞鐵離子的好氧與厭

1、中性pH條件下化能異養(yǎng)硝酸鹽還原菌對亞鐵離子的好氧與厭氧 氧化Arch Microbiol998, 169:159-165 IF= 1.975摘 要：百分之九十的厭氧富集培養(yǎng)都出自于一些淡水沉積物試樣以及一些海洋沉積物，在 pH 7.2、30C條件下下，沉積物中的亞鐵離子在硝酸鹽和有機輔助物的礦物媒介中被氧化。 厭氧硝化的亞鐵氧化是一個生物過程。從苦咸水沉積物中分離出的一種微生物(HidR2，運 動型不產芽孢的革蘭氏陰性棒狀菌)，進一步研究在醋酸鹽環(huán)境中對亞鐵離子的氧化作用。在微量醋酸鹽(0.21.1 mM)環(huán)境中,pH 7.2、30C條件下，HidR2菌能厭氧和好氧氧化0.74.9 mM的亞

2、鐵離子，其用于生長的能量來自于亞鐵離子的厭氧硝化氧化，鐵氧化比率是一個常 數(shù)，取決于醋酸鹽的量的給予。中性條件下硝酸鹽厭氧氧化亞鐵離子的能力似乎是嗜溫反硝 化細菌的共有特性。由于依賴硝酸鹽的鐵離子氧化關閉沉積物缺氧區(qū)的鐵循環(huán)、鐵離子的好 氧氧化促進含氧區(qū)內的二價鐵再氧化為三價鐵，這兩個過程都增加了鐵離子在自然沉積物的 有機質循環(huán)轉化中作為過渡電子載體的重要性。關鍵詞：鐵氧化亞鐵離子高鐵離子硝酸還原作用沉積物1引言鐵元素是地殼中含量最豐富的元素之一，也是含量第二豐富的金屬元素。由于其低水 溶性，鐵氧化物在水環(huán)境中通常以沉淀形式存在，如復雜的非晶形或晶體結構(Cornell and Schwert

3、mann 1996)。三價鐵離子能夠被異養(yǎng)菌還原為二價鐵離子(Lovley 1991)，在有氧條件下，亞鐵離子可 以在低pH值中被嗜酸細菌如氧化亞鐵硫桿菌再次氧化(Blake et al. 1993)，或者在近中性環(huán) 境里，被鐵銹色披毛菌氧化(Hallbecket al. 1993)，這兩種細菌都是從氧化還原反應中獲取能 量而生長。Fe3+/Fe2+的標準氧化還原電位為+770 mV，但是在自然環(huán)境中其實際的氧化還原電位很 大程度上取決于pH值的變化(Widdeletal. 1993)。在pH 7的碳酸氫鹽環(huán)境下，F(xiàn)eOOH/FeCO3 的氧化還原過渡電位E值約為+200 mV。在較低的氧化還

4、原電位下，亞鐵離子也能夠充當給電子體，從而在厭氧環(huán)境中發(fā)生還原 反應，最近有研究者可以分離和描述能利用亞鐵離子作為電子供體的不產氧光合細菌 (Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994 +200 mV下的釋放電子也可以用作微生物的 硝酸鹽異化作用，最近報道了一種嗜溫細菌(Straub et al, 1996)和一種極端嗜熱的古細菌 (Hafenbradl et al, 1996)都具有這種新陳代謝功能。這一過程將鐵循環(huán)和氮循環(huán)聯(lián)系上，因此 也顯示了微生物厭氧環(huán)境中鐵離子作為電子受體的重要性。本文主要研究在兼性厭氧硝酸還 原菌輔助作用下亞鐵離子的

5、氧化過程。2材料和方法2.1微生物的來源由于采取加富培養(yǎng)，各種沉積物試樣被作為接種源，有淡水源(Vorsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany)、海水源(Venice, Italy; Ameland and Groningen, Netherlands )、鹽水源(Hiddensee,Germany)以及市政污水處理中使用的活性污泥源(Ko nstanz,Germany)。2.2培養(yǎng)介質和培養(yǎng)方法對于淡水和海水中細菌的加富培養(yǎng)，使用在缺氧條件下的碳酸氫鹽緩沖溶液作礦質媒 介，且加入1mM的硫酸鹽作為硫源，不需加還原劑，NaCl和MgC

6、l2的濃度則與微生物本身 的環(huán)境相適應，淡水中NaCl和MgCl2 6H2O的量分別為1.0 g和0.4 g，鹽水中為7.0 g和1.0 g 海水中則為20.0 g和3.0 g。經高壓滅菌，N2/CO2 (80:20, v/v)冷卻后，每升溶液中分別加入1 ml 微量元素溶液 SL9(Tschech and Pfennig 1984)和7-維生素溶液(Widdel and Pfennig 1981)，并將pH調至7.2,。而對于需氧培養(yǎng)實驗，培養(yǎng)基仍和上述方法一樣，所不同的是緩 沖溶液由羥乙基哌嗪乙硫磺酸所替代。2.3富集與分離將50ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基裝入120ml規(guī)格的血清瓶中，用丁基橡

7、皮塞密封好，在缺 氧條件下往里加入約5ml的接種體。并無菌地向基底分別注入濃度為4mM硫酸亞鐵和5mM 硝酸鹽。每個接種體均在pH為6.5、7.0、8.0，溫度為16和30C下富集培養(yǎng)。培養(yǎng)周期為24 周，以棕色銹狀沉淀形成為一個周期?？嘞趟囵B(yǎng)的細菌的純化是用的瓊脂稀釋法(Pfennig and Truper 1981)： 60C下向25ml 的試管中加A3ml 3% (w/v)的瓊脂溶液，再加入8 mM硫酸亞鐵溶液，小心混勻，然后， 加入7ml 42C預熱的含5 mM硝酸鹽培養(yǎng)基，得到的亞鐵離子最終濃度為4 mM。每根稀釋后 的試管都經過密封、接種、水域冷凝以及N2/CO2 (80:20,

8、 v/v)氣體吹掃，最后置于避光的30C 恒溫箱中培養(yǎng)。在進入液體培養(yǎng)基前，微生物都是在瓊脂上生長繁殖的。淡水和海水微生物的純培養(yǎng)在平板基上分離。平板基的基質也是上述培養(yǎng)基加入).01M 丙磺酸作為緩沖溶液、1.5% (w/v)的瓊脂、5mM硝酸鹽和3 mM醋酸鹽。在30C， N2/CO2(80:20, v/v)氣氛下進行避光平板接種。培養(yǎng)好的菌種轉移到呈有淡水培養(yǎng)基的血清瓶 (60ml )中。只有在瓶子中進行亞鐵離子氧化的微生物才在瓊脂板上顯示多于兩條條紋從 而得以純化，并且將其轉移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在含有礦物質元素和0.2%的酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物在顯微鏡下進行純化檢 查。培養(yǎng)期

9、間需定期用顯微鏡檢查微生物是否被污染。檢測鞭毛是否形成，使用的方法是布 雷登-戈登堡銀侵染法。2.4增長實驗細菌在裝有300m l培養(yǎng)基的瓶(500ml)中培養(yǎng)，未接種的空白試驗瓶在相同條件下培 養(yǎng)至少兩個月，但是始終未見到有能氧化二價鐵離子的微生物產生。經過震蕩后的樣品放入 具塞瓶中，用N2/CO2 (80:20, v/v)氣預吹，然后轉移到鹽酸或者磷酸緩沖溶液中準備下一步分 析。為保證在氧氣梯度管中的生長實驗，將4ml缺氧培養(yǎng)基裝入22ml試管中，培養(yǎng)基中含 有1.5% (w/v)瓊脂糖、15 mM亞鐵離子、1 mM醋酸鹽。在氮氣保護下，等第一層凝結后， 再加入第二層培養(yǎng)基(0.5% (w

10、/v)瓊脂糖)，將微生物接種在這一層上。等到第二層氮氣保護 下凝固好以后再往上面加入1ml原培養(yǎng)基不含瓊脂糖，為的是防止第二層瓊脂糖的干結。試 管用鋁蓋輕輕蓋上，垂直放入暗箱中在30C下，振蕩培養(yǎng)(80rpm)。以上所有試驗重復一 遍2.5分析方法亞鐵離子的量用亞鐵嗪分光光度法來測定(Stookey 1970)?？傝F離子的濃度測定也是用 同樣的方法即加入鹽酸羥胺將所有的鐵離子都還原成亞鐵離子態(tài)(Stookey 1970)。三價鐵離 子則有上述二者差值得到。為得到亞硝酸鹽的含量，樣品與一體積500mM的磷酸緩沖溶液 在厭氧環(huán)境下混合，并在室溫下反應15分鐘，然后在離心機上用最大轉速離心5分鐘。用

11、1ml 1M的鹽酸將其又恢復粒子態(tài)。這樣處理可以避免亞硝酸鹽在分析前和分析過程中被亞鐵離 子所氧化。如果試樣中含有超過1mM的亞硝酸鹽，則這個過程必須重復至少兩次。由于鐵 離子分析是在梯度管中進行的，所以瓊脂糖要用刀片切成2mm后的薄片并加A1ml 5M的鹽 酸。在40 C水浴中靜置15分鐘后，薄片已被酸化成液體，鐵離子在上述過程中被測量完畢。 硝酸鹽和亞硝酸鹽用帶有格魯姆陰離子交換柱(Grom, Herrenberg, Germany)的高效液相色譜 來進行定量分析，在220nmT進行吸收檢測。為了抑制鐵離子和亞硝酸鹽的相互反應，并且 為保護色譜柱，含鐵樣品中得加入磷酸緩沖溶液，上清液用于硝

12、酸鹽亞硝酸鹽的檢測。這種 方法的對亞硝酸鹽的檢出限大約是30 pM。醋酸鹽用氣相色譜(GC6000 Vega Series 2; Carlo Erba, Milan, Italy)分析，使用填充柱 (2 mx2mm; 60/80 Carbopack C/0.3% carbowax 20 M/0.1% H3PO4)，火焰離子檢測器。為了 保護柱子，醋酸鹽試樣也按上述方法準備。氧化二氮也用上述氣相色譜分析，使用的填充柱 2 mx2 mm; 60/80 Carbosieve SII (Supelco, Bellefonte, Pa., USA)和檢測器(熱導池檢測器) 不一樣。根據(jù)Hall和Alle

13、r (1992)，銨鹽用流動注射分析。蛋白質由以下分析：測定含鐵樣 品中蛋白質的含量，需要準備含有試樣中相同鐵量的蛋白質標樣，為的是測定蛋白質化學分 析中與鐵離子的可能反應。由于幾種HidR2菌所對應的不同的光密度的蛋白質含量與干重呈 一種相關關系，根據(jù)這種關系，可以來計算蛋白質的干重。梯度管中的氧含量用三維顯微操作器驅動氧微電極而測定。3結果3.1富集培養(yǎng)在710天的培養(yǎng)下，除了威尼斯海峽采集的沉積物以外，所有的富集培養(yǎng)都形成了棕色 銹狀沉淀。通過化學分析，這些沉淀都被確定為鐵的氫氧化物，而在未富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基里 都未發(fā)現(xiàn)亞鐵的氧化作用。經過三到四次轉移培養(yǎng)，需加入醋酸鹽或者琥珀酸鹽作為有機

14、補 給物以維持亞鐵離子的氧化作用環(huán)境。只有從格羅寧根市海洋沉淀物中富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基不 用加入補給物而能不斷氧化亞鐵離子，即使重復轉移一年以上也能進行反應。在比較所有富 集培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，無論是在16C或30C還是?日為6.5或8,亞鐵離子的轉化率和潛伏程度都沒有 明顯的改變。3.2純培養(yǎng)的特征從所有能發(fā)生亞鐵離子氧化反應的富集培養(yǎng)中來看，純培養(yǎng)獨立的顯示了亞鐵離子厭 氧氧化過程中醋酸鹽是作為有機補給物而硝酸鹽則是作為電子受體。從波羅的海沉積物中分 離出來的HidR2菌種將被作為進一步研究的對象。圖1 HidR2菌在醋酸鹽和硝酸鹽厭氧生長中的相差顯微鏡照片(圖中橫杠表示10微米)HidR2菌屬于革蘭

15、氏陰性，不產孢子的桿菌，大小為36X1呻(圖1)，單極鞭毛運動 型，對氧化酶和過氧化氫酶產生極性。通過相差顯微鏡觀察到細胞兩端有微小深色包涵體， 用三氯甲烷處理后，這些包涵體消失，可能是由于聚羥基脂肪酸的富集產生。在過量醋酸鹽 03 mM)中培養(yǎng)后，HidR2菌每一批能產生約1050個細胞。在含有亞鐵離子、醋酸鹽和 硝酸鹽的液體培養(yǎng)基中，通過4,6-二脒基-2-苯吲哚鹽酸染色法，可以發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細胞都含 有絮狀的三氧化鐵或者肉眼可見的姜鐵礦，但氫氧化鐵并非包裹在細胞外部。在含醋酸鹽和硝酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基中，HidR2菌形成的則是白色松軟的菌落。在在含亞鐵離子、醋酸鹽和 硝酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基里，形成

16、的是深褐色的邊緣不規(guī)則的球形菌落。此菌的溫度適宜范圍是 540C，最適溫度是33C, pH范圍在5.59.5之間，最適pH是7.5。在含硝酸鹽、亞硝酸鹽 或者氧化二氮的厭氧環(huán)境中或者在好氧環(huán)境中與氧反應的時候，HidR2菌始終是作為電子受 體。且在含有硫酸鹽、延胡索酸鹽或無定形氫氧化鐵（作為電子受體）Lovley and Phillips 1986 以及醋酸或琥珀酸鹽（作為給電子體）的培養(yǎng)基中，HidR2菌不能生長。經測試和氧化后的 給電子體有葡萄糖、果糖、木糖、樹膠醛糖、丙酸鹽、丁酸鹽、L-乳酸鹽、異丁酸鹽、琥珀 酸鹽、乙二醇、乙醇、甘氨酸和酵母膏；異戊酸、苯酸鹽、甲醇和氨則不能被氧化。3.

17、3 HidR2菌對亞鐵離子的厭氧氧化作用在沒有有機補給物的厭氧環(huán)境中，HidR2菌不能生長也不能對亞鐵離子的氧化進行有效 的測量，而加入醋酸或者琥珀酸以后效果就發(fā)生了明顯的變化。304054 ED 7Q eoTim-e (h)251的1510 rEcnmc還芝CLW152035Time (days)Acgse. e(mW) 9 B 4 2如CE 5rl)ssOJd 言BpAosmCF32 5 4 s 2 1- D圖2 a，b 在pH 6.7、30C，含有硝酸鹽和醋酸鹽的培養(yǎng)基中，HidR2菌對亞鐵離子的厭氧硝化氧化作用， 亞硝酸鹽未檢測到（檢出限為30aM）o a.不含亞鐵離子；b.含有亞鐵離

18、子。:蛋白質:硝酸鹽。： 醋酸鹽:亞鐵離子:鐵離子在pH 6.7、30C條件下，醋酸鹽作為補給物，既記錄了HidR2菌對亞鐵離子的厭氧硝化 氧化作用，并且與不含亞鐵離子的做了對比。在含有亞鐵離子的培養(yǎng)基里，細胞以指數(shù)方式 生長，這種速度能持續(xù)45個小時。隨著醋酸鹽的消耗，大約14天左右細胞仍以兩倍速度增長， 這取決于初始醋酸鹽的濃度值。在沒有亞鐵離子的培養(yǎng)基里，細胞以指數(shù)形式增長只能維持 11個小時。從表1可以看出，HidR2菌在醋酸鹽和亞鐵離子作為底物的情況下，將硝酸鹽轉 化為了氮氣和氧化二氮，這一點和其他種類的微生物作用一樣。這一過程中并沒有形成氨， 因為氨不能在厭氧環(huán)境中氧化。在高壓滅菌

19、處理后，同樣的試驗方法沒有得到亞鐵離子氧化 和蛋白質量增加的結果。表1總結了厭氧條件下含和不含亞鐵離子的情況，指出亞鐵離子的氧化并不完全，添加 的亞鐵離子只有近90%被氧化。通過加入1mM的醋酸鹽或者5mM的亞硫酸鐵，也不能改變 這一比例，這表明細胞無法利用剩余的亞鐵離子。為證明醋酸鹽對亞鐵離子氧化程度的影響，設計了一系列不同醋酸鹽濃度的生長實驗 （圖3）。約每增加1mM醋酸鹽能夠穩(wěn)定地影響鐵離子氧化的量，每消耗1mol的醋酸鹽就會 反應4mol的亞鐵離子。當超過供給鐵離子的90%以后，即使再增加醋酸鹽的量，鐵離子也不 會再被氧化。3.4 HidR2菌對亞鐵離子的好氧氧化作用圖4給出了在含有梯

20、度氧濃度和亞鐵離子以及少量醋酸鹽的半固體培養(yǎng)基中，通過 HidR2菌新陳代謝對鐵和氧的形成的影響。將未接種的試管中也進行了同樣的試驗，為的是 觀察生物和化學氧化鐵離子的不同。微生物在空氣環(huán)境中培養(yǎng)4周，在培養(yǎng)后，在瓊脂糖下 面形成了一片一片表面光滑且多層薄而緊密的多層含鐵層。而在對照管內并沒有形成上述一 樣的層面，而是形成的橘色的鐵離子層，比上述管內的層面要淺，但是更寬?；瘜W分析表明： 相對于未接種HidR2菌的化學氧化而言，三價鐵沉淀物的最大條帶在瓊脂培養(yǎng)基中位置要深 很多，其氧分壓也要低很多，因此可以證實肉眼觀察到的現(xiàn)象：二價鐵可被HidR2菌有氧氧 化。顯然，HidR2菌細胞能將大部分三

21、價鐵固定到明顯的一層，這一點在自然沉積物中也有 發(fā)現(xiàn)。表1 HidR2菌在含有醋酸鹽和硝酸鹽的培養(yǎng)基中，加鐵和不加鐵的厭氧生長情況下，其生長化學當量比和 底物轉化情況。每一列代表著添加各種濃度的醋酸鹽和亞硫酸鐵的獨立實驗。低濃度醋酸鹽對應著低的細 胞產率（第一、二列）不能給出可靠的蛋白質形成試驗；相反地，在高濃度醋酸情況下的實驗（第三、四 列）下，表中也沒有關于干重的計算。所以用于細胞合成的電子也沒有考慮在平衡計算中（第一、二列）（nd表示未檢測到）。Presence of FeSO4 WithoutFeSO4Acetate supplied andconsumed (niM)0.21.13.

22、12.8FeSO+ supplied (mM)6.46.45.9Fe(ni) fonned (mM)0.74.943Nitrate consumed (mM)0.53.15.13.2Nitrite fcnned (niM)0000N2O formed (mM)0.060.771.60Cell dry mass formed (mg/1)ndnd5839Acetate assimilated (niM)andnd1.20.8Acetate oxidized CniM)b0.21.11.92丫烏(g diy mass niol acetate)ndnd3120Electrons recovered

23、 (%)c106108123100a醋酸鹽的量是以C4H7O3形式的干重計算，根據(jù)方程：17acetate+11H+8C4H7O3+2HCO3-+4OH-b醋酸鹽氧化的量是根據(jù)醋酸消耗量減去醋酸累計量c電子的回收率是用消耗硝酸鹽氧化為氮氣和部分氧化二氮減少的電子除以從醋酸鹽氧化得到的電子（第 四列）或者是從加了鐵鹽的醋酸鹽氧化中的電子（13列）得到的。由于第一、二列沒有計算出醋酸的氧化， 所以可以得出醋酸是100%的消耗掉。Acetate supplied （mM）3E圖3培養(yǎng)基中含有8mM亞硫酸鐵和5mM硝酸鹽以及各種濃度的醋酸鹽條件下，HidR2菌對亞鐵的氧化和醋酸的消耗情況。在pH=6.

24、8，30C下避光培養(yǎng)3周。3.5化學方法亞鐵氧化作為對照試驗化學方法氧化亞鐵離子的條件和HidR2細菌的生長條件采用的是一樣的，由于分子氧能很容易地氧化亞鐵，例如不包含培養(yǎng)液的條件就可以檢查分子氧通過穿透橡膠塞導致鐵產生 化學性氧化。這種方法顯示了在上述條件下培養(yǎng)6周也不會檢測到亞鐵離子的氧化。向pH為6.7含8mM亞鐵離子的厭氧培養(yǎng)基中加入5mM的亞硝酸鹽可以加快亞鐵離子的 氧化速度。在4天內，亞鐵離子的氧化速度為8如/h，而要消耗約0.8mM的亞硝酸鹽。而當加 A1mM和0.3mM的亞硝酸鹽時，在相同條件下均未檢測到亞鐵離子的氧化作用。0Fe(lll) (mM) 10203040 i i

25、i p ii02060tia 1DDOxygen % air saturation)Fe(lll) (m.M)IQ 203044Oxygen (% air saturatiion)圖4 a, b在30C搖床上培養(yǎng)30天后，瓊脂氧-二價鐵梯度管中三價鐵和氧的變化。a是HidR2菌的培養(yǎng)情況； b是對照實驗。條狀代表三價鐵，圓點代表氧。4討論在本文中，已經很詳細的介紹了脫氮細菌在pH 7.2和30C下加入少量有機補給物而觀察 在厭氧和好氧條件下對亞鐵的氧化作用。鑒于在3日7.2下亞鐵離子有很強的親氧能力，控制 氧條件是很有必要的，主要是要區(qū)分生物氧化和非生物氧化亞鐵離子。一定要注意避免氧從塞子進入

26、培養(yǎng)基中，并且亞硝酸鹽也要在培養(yǎng)過程中隨時檢測，因 為在硝酸鹽反應過程中亞硝酸鹽可能富集，而它可以促進亞鐵離子的化學氧化（Komatsu et al. 1977; Moraghan and Buresh 1977; Christianson and Cho 1983; Brons et al. 1991）。由于HidR2菌 在有機輔助物存在下能形成大量的三價鐵離子，所以我們要排除由于硝酸鹽還原產生的亞硝 酸鹽和氧化二氮的化學氧化的干擾，對照試驗可以得出以下結論：氧氣穿透橡膠塞進入培養(yǎng)基中氧化亞鐵這個假設不成立，因為在沒有微生物中的對 照瓶中經過6周都沒有檢測到鐵離子氧化作用。在HidR2菌的培

27、養(yǎng)基中，亞硝酸鹽的促進作用也不成立，因為高于30MM （檢出限） 的濃度下也沒有被檢測到;如果亞硝酸鹽濃度在幾個毫摩下才會對亞鐵離子的化學氧化產生 影響，眾所周知，這種情況只會發(fā)生在一些分批培養(yǎng)的脫氮劑中。氧化二氮的對亞鐵氧化的影響同樣可以被排除，因為濃度為50ml/l的氧化二氮（Straub et al. 1996），相當于2mmol/l，不會對鐵產生氧化。由于所有化學氧化實驗我們都按照生物實驗條件來開展的，可以證明厭氧硝酸鹽化的亞 鐵離子氧化作用是一個生物催化反應。我們證明了 HidR2菌能夠利用從亞鐵離子氧化過程中得到的電子用于其異氧新陳代謝， 從而獲取能量。這一結論是基于HidR2菌的

28、產率比較，在含有亞鐵離子的培養(yǎng)基的產率要比 只含醋酸鹽的產率高55% （表1）。HidR2菌的質量仍然是隨著醋酸鹽的減少而增加（圖2）的 也能支持這一結論。很明顯，醋酸鹽在HidR 2菌的細胞合成過程是必不可少的，此微生物不 是自養(yǎng)型的。然而，醋酸鹽并不是完全同化于細胞中，部分醋酸鹽也反應在了多余的亞鐵鹽 中。當以足量醋酸鹽給予反應時，其氧化反應和鐵的是同時進行的，且以1:4的速率進行著 （圖3）。顯而易見的是，醋酸鹽氧化所提供的電子用于醋酸吸收，這些電子不能在氧化鐵時 被細胞所還原，可能是由于缺乏適合的反電子傳遞系統(tǒng)。含每摩爾醋酸的細胞產量(干重14g) 和每摩爾醋酸加了 4摩爾亞鐵的細胞產

29、量(19g)比較可以看出，在細胞新陳代謝機制(1.75g/mole-)中，醋酸電子(EJ=290mV)要比亞鐵氧化(1.0g/mol e-，E=200mV)產 生的電子效用高兩倍以上。這一結論可以很好的解釋所有的能量都由硝酸鹽的電子轉移而產 生2 NO3 公2的EJ=+751mV所有計算都是基于Thauer et al, (1977)。當在含有亞鐵離子的厭氧環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)HidR2菌生長緩慢，但這一現(xiàn)象并不一定是與鐵 氧化代謝有關，可能是由于過量亞鐵中毒的現(xiàn)象，或者是由于磷酸鹽或其他微生物營養(yǎng)物的 低利用效率，也可能是這些營養(yǎng)物質與鐵發(fā)生了沉淀反應(Hughes and Poole 1991)。關于鐵厭氧氧化的生化作用仍然有幾個公開的問題。要觀察能量節(jié)省需要一個質子能夠 穿過細胞膜而轉移出來，我們并不知道亞鐵離子是在細胞的那個部位氧化的，在亞硝酸鹽和 氧化二氮存在的條件下，如果亞鐵氧化定位在胞外質的話，問題就是形成的氫氧化鐵是如何 轉移到培養(yǎng)基中的。例如，亞鐵離子還能夠在細胞外面發(fā)生氧化反應。這就需要一個電子轉 移系統(tǒng)穿過胞外質(如細胞色素)Stouthamer 1991; Ferguson 1994。