現(xiàn)代生物技術(shù)在海洋藥物研究中的應(yīng)用

1、現(xiàn)代生物技術(shù)在海洋藥物研究中的應(yīng)用論文導(dǎo)讀：現(xiàn)代生物技術(shù)在海洋天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)和海洋藥物研究中的應(yīng)用主要表達(dá)在海洋天然活性產(chǎn)物的篩選以及利用生物技術(shù)生產(chǎn)海洋藥物兩個(gè)方面，此外，其在海洋生物的培養(yǎng)以及海洋天然產(chǎn)物的別離純化等過(guò)程中也得到了廣泛的應(yīng)用。廣義的海洋藥物基因工程是指利用源自海洋的藥物基因重組生產(chǎn)藥用蛋白(或多肽)或以海洋生物作為生物反響器;生產(chǎn)藥用蛋白(或多肽)，因此，可按照供體基因的來(lái)源以及表達(dá)體系的不同，將其分為2個(gè)研究方向:其一是海洋藥物基因的重組表達(dá)、其二是海洋生物反響器。關(guān)鍵詞：現(xiàn)代生物技術(shù)，海洋藥物現(xiàn)代生物技術(shù)作為融合現(xiàn)代生命科學(xué)與多學(xué)科理論研究手段的高新技術(shù)，在世界范圍內(nèi)為新

2、型藥物的研究與開(kāi)展開(kāi)辟了廣闊的前景。各種生物技術(shù)在藥物研究領(lǐng)域的交互應(yīng)用倍受矚目，如模型篩選和藥靶發(fā)現(xiàn)，基因組和蛋白質(zhì)組研究、生物信息和藥物設(shè)計(jì)，新型給藥系統(tǒng)與納米技術(shù)等，以發(fā)現(xiàn)和確證新型藥物為主要目標(biāo)，在生命科學(xué)前沿取得了快速的開(kāi)展【1】?，F(xiàn)代生物技術(shù)在海洋天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)和海洋藥物研究中的應(yīng)用主要表達(dá)在海洋天然活性產(chǎn)物的篩選以及利用生物技術(shù)生產(chǎn)海洋藥物兩個(gè)方面，此外，其在海洋生物的培養(yǎng)以及海洋天然產(chǎn)物的別離純化等過(guò)程中也得到了廣泛的應(yīng)用。1 海洋藥物的別離純化在已發(fā)現(xiàn)的1000余種有活性的海洋天然產(chǎn)物中，絕大多數(shù)屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)以及聚酯類(lèi)等成分，可通過(guò)植物化學(xué)手段，依據(jù)這些成分的

3、極性不同，利用不同的溶劑系統(tǒng)加以別離，此外，CO2超臨界萃取技術(shù)以及各種層析技術(shù)也開(kāi)始廣泛應(yīng)用于這些小分子的別離純化過(guò)程。在海洋生物體內(nèi)存在著一些肽類(lèi)和蛋白質(zhì)，具有很高的抗腫瘤、抗菌、抗病毒以及抗凝血等活性，如: 張成武等【2】研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻藻藍(lán)蛋白在80mg-L 1濃度時(shí)對(duì)人血癌細(xì)胞株HL60有極顯著的抑制作用，在20mg-L - 1濃度時(shí)對(duì)K562 和U2937 細(xì)胞均有顯著抑制作用；另有報(bào)道從鱉魚(yú)肝臟中別離到的一種肝刺激物質(zhì) (sHSS)可以明顯抑制乙肝病毒模型鴨血清中HBV的DNA水平【3】，并可以顯著抑制CCl4致肝損傷模型小鼠血清中ALT和AST活性，具有明顯的保肝護(hù)肝功能【4】

4、 。在肽類(lèi)和蛋白質(zhì)的別離純化過(guò)程中，一般根據(jù)目的蛋白的分子量和極性等性質(zhì)，采用凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析以及制備電泳等方法加以別離純化。由于大多數(shù)具有生物活性的多肽是在生物機(jī)體的特定發(fā)育階段表達(dá)的，因此，在樣品的采集過(guò)程中，需要考慮目的蛋白的富集問(wèn)題，取特定發(fā)育階段的樣品可以提高目的產(chǎn)物的回收率；此外由于這些活性多肽在生物機(jī)體內(nèi)是以微量形式存在的，需根據(jù)目的產(chǎn)物的熱、酸堿穩(wěn)定性以及分子量大小，通過(guò)熱提、調(diào)節(jié)提取液的pH以及超濾等過(guò)程去除大多數(shù)雜蛋白以提高別離純化的效率。關(guān)于別離純化蛋白的理化性質(zhì)的研究，一般可采用等電聚焦電泳、變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜、氨基酸組成及序列分析以及圓二色

5、譜等方法，對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、分子組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行全面的分析;對(duì)一些新型未知功能的蛋白質(zhì)和多肽，還可以通過(guò)核磁共振、x-衍射及計(jì)算機(jī)輔助分析的方法，對(duì)它們進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，以探討可能的構(gòu)效關(guān)系。2 海洋藥物的大規(guī)模篩選系統(tǒng)通過(guò)篩選而獲得具有生物活性的先導(dǎo)化合物，是海洋藥物研究的關(guān)鍵，目前藥物篩選模型已經(jīng)從傳統(tǒng)的整體動(dòng)物、器官和組織水平開(kāi)展到細(xì)胞和分子水平。天然產(chǎn)物的篩選途徑主要有三種:一種是建立在對(duì)生物組織成分分析根底上的組成引導(dǎo)型;第二種是利用傳統(tǒng)的植化分析手段對(duì)生物機(jī)體內(nèi)的一些具有特定極性的成分進(jìn)行別離研究，并通過(guò)一些特殊的設(shè)備對(duì)別離到的成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的化學(xué)結(jié)構(gòu)引導(dǎo)型;第三種

6、是以活性檢測(cè)為引導(dǎo)的天然活性成分研究，即活性引導(dǎo)型;，此方法的特點(diǎn)是利用一些藥物篩選模型，對(duì)別離出的天然成分進(jìn)行篩選，從中篩選具有特定生物活性的產(chǎn)物，因其目標(biāo)極為明確，容易從大量的天然產(chǎn)物中鎖定;目標(biāo)產(chǎn)物【1】。前兩種方法那么因?yàn)閯e離出的組分大多不具備生物活性而導(dǎo)致大量無(wú)效的工作。近年來(lái)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及生物芯片技術(shù)的開(kāi)展，建立在分子和細(xì)胞水平上的高通量篩選( High Throughoutscreening， HTS)技術(shù)已日趨成熟，因該方法具有樣品用量少、工作效率高、篩選費(fèi)用低廉以及可較好地反映藥物作用的機(jī)制等特點(diǎn)，歐美一些興旺國(guó)家已將這種篩選力一法作為常規(guī)的新藥篩

7、選途徑，我國(guó)在此方面的工作起步較晚，到目前為止，我國(guó)建立在分子和細(xì)胞水平的新藥篩選模型僅有400余種。2.1 基因芯片技術(shù)基因芯片又稱(chēng)DNA芯片或DNA微陣列，屬于生物芯片的一種。生物芯片是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過(guò)程集成于芯片外表，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽、蛋白質(zhì)及其他生物成分的高通量快速檢測(cè)【5】。Scherf【6】等用含10000個(gè)基因的微陣列對(duì)60個(gè)腫瘤細(xì)胞系的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大局部細(xì)胞系保存了其原代別離組織的特征基因表達(dá)，又進(jìn)一步評(píng)價(jià)122種藥物對(duì)這些細(xì)胞系基因表達(dá)的影響，從中篩選出抗腫瘤藥物候選化合物，并對(duì)其作臨床藥效評(píng)價(jià)。通過(guò)基因技術(shù)分析不同藥物的療效差異，

8、可以識(shí)別患者個(gè)體的差異，尤其是對(duì)疾病的易感性的差異和對(duì)于藥物反響的差異的識(shí)別是個(gè)性化醫(yī)學(xué)的根底?；蛐酒捎脕?lái)比擬中藥用藥前后組織(細(xì)胞)中基因表達(dá)的變化，所發(fā)現(xiàn)的一組基因很可能是藥物作用的靶點(diǎn)，可作為進(jìn)一步藥物篩選或驗(yàn)證的靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，香港科技大學(xué)生物技術(shù)研究所利用基因芯片已篩選到知母的23種有效成分，如果再?gòu)腸DNA表達(dá)文庫(kù)中得到的肽庫(kù)制作肽芯片，那么可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的局部物質(zhì)。它能使新藥篩選高度并行、高通量、微型化、自動(dòng)化，大大提高新藥研制速度【7】。2.2 基因敲除以及基因?qū)爰夹g(shù)基因敲除和基因?qū)思夹g(shù)是20世紀(jì)80年代后期利用基因重組技術(shù)開(kāi)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，其技術(shù)

9、根底是胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的別離和體外培養(yǎng)技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病理模型和新藥篩選模型的建立中。其機(jī)制是通過(guò)對(duì)一些重大疾病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)，對(duì)一些模式動(dòng)物(如小鼠等)的染色體進(jìn)行操作，在其染色體中刪除(deletion)或?qū)? transformation)這些基因，使動(dòng)物發(fā)生性狀上的改變(表現(xiàn)為相關(guān)疾病的病癥)，此模型因更接近于臨床疾病的表型，因而更適合于新藥的篩選工作，具有篩選準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。3 海洋藥物基因的克隆技術(shù)一般來(lái)說(shuō)，具有很高生物活性的物質(zhì)在海洋生物體內(nèi)是以微量的形式存在的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床前藥學(xué)研究的需要的。為獲得足夠的中試樣品，一般可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物，由

10、于目前有關(guān)海洋生物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)還不夠完善，且實(shí)驗(yàn)室的條件與海洋生物生活的環(huán)境具有很大的差異，因此，為使培養(yǎng)的細(xì)胞能大量產(chǎn)生目的產(chǎn)物，還需要不斷的摸索海洋生物細(xì)胞的培養(yǎng)方法和發(fā)酵條件；另一種可行的途徑是通過(guò)現(xiàn)代基因工程技術(shù)獲得大量表達(dá)的重組產(chǎn)物?？寺⌒禄虻姆椒ㄓ卸喾N，在蛋白序列如蛋白質(zhì)的N端序列的情況下，一般可以根據(jù)其N(xiāo)端氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR和RACE-PCR方法從組織中獲得該蛋白相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。另一種克隆新基因的方法是根據(jù)其它陸生生物基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從生物組織的總RNA提取物中克隆目的基因，此方法在克隆親緣關(guān)系較近物種的同源基因方面往往很

11、容易獲得成功，但是，由于陸生生物和海洋生物的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，兩者體內(nèi)的蛋白基因在同源性方面可能不高，因此，在同源基因的克隆方面需要慎重。最有效的新基因克隆方法是對(duì)生物特定組織的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。因此，插人的cDNA片段可表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，具有定的抗原性和生物活性，將別離到的天然蛋白通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體后，可通過(guò)抗原抗體反響的方法從cDNA文庫(kù)中篩選到目的基因;也可以用天然產(chǎn)物免疫小鼠或兔，獲得通過(guò)減法雜交(Subtractivehybridization)或差異顯示技術(shù)(DifferentialDisplay RT-PCR)獲得生物體特定發(fā)育時(shí)期表達(dá)的基因或基因片段(需要通過(guò)文庫(kù)篩選

12、的方法獲得。通過(guò)對(duì)它們的重組表達(dá)產(chǎn)物的活性研究，也可能獲得具有藥用開(kāi)發(fā)潛力的藥用蛋白或多肽。最新研究進(jìn)展有：將DNA微陣列技術(shù)在海綿細(xì)胞培養(yǎng)上進(jìn)行了應(yīng)用，構(gòu)建了斑節(jié)對(duì)蝦遺傳連鎖圖譜，建立了海洋紅藻EST，從海星卵母細(xì)胞中別離出成熟蛋白酶體的催化亞基，初步說(shuō)明硬骨頭魚(yú)類(lèi)IGF2I原E2肽具有抗腫瘤作用； Ahsan等克隆了鰻魚(yú)胰蛋白酶原基因；Richardson等克隆了東方的干擾素調(diào)節(jié)因子基因并分析了其基因組結(jié)構(gòu)；Mitsuo等克隆了一種新的鰻魚(yú)細(xì)胞色素P450cDNA；Maccatro等克隆了真鯛肌肉生長(zhǎng)抑制因子基因。4 海洋藥物基因工程廣義的海洋藥物基因工程是指利用源自海洋的藥物基因重組生產(chǎn)

13、藥用蛋白(或多肽)或以海洋生物作為生物反響器;生產(chǎn)藥用蛋白(或多肽)，因此，可按照供體基因的來(lái)源以及表達(dá)體系的不同，將其分為2個(gè)研究方向:其一是海洋藥物基因的重組表達(dá)、其二是海洋生物反響器。4.1 海洋藥物基因的重組表達(dá)利用現(xiàn)代生物技術(shù)，如基因工程、發(fā)酵工程以及細(xì)胞工程等技術(shù)，使得獲得海洋活性多肽或蛋白不再依靠大量采集海洋生物。近幾年來(lái)的主要進(jìn)展包括:McKenna等 將IPNV病毒的A片段基因重組到Semliki森林病毒表達(dá)載體PSFV1上，獲得了重組的IPNV蛋白; 秦松【2】等在克隆到別藻藍(lán)蛋白(APC)基因后，利用DNA重組技術(shù)將該基因與大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)基因構(gòu)建成嵌合

14、基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達(dá)MBP-APC融合蛋白的基因工程菌株，該重組產(chǎn)物具有明顯的抑制小鼠S180肉瘤的活性。4.2 海洋生物反響器海洋藥物與其他生物藥物一樣都經(jīng)歷了三個(gè)開(kāi)展階段:(1)采集和加工野生資源;(2)人工栽培和養(yǎng)殖藥源;(3)把藥物基因轉(zhuǎn)入易轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)快和表達(dá)率高的生物種類(lèi)中表達(dá)。隨著生命科學(xué)進(jìn)入基因時(shí)代，第三個(gè)階段的開(kāi)展在加快。生物反響器( Bioreactor)一般是指利用固定化酶及固定化細(xì)胞高效生產(chǎn)產(chǎn)物的技術(shù)。雖然海洋中任何一種生物都有可能作為表達(dá)外源藥物基因的生物反響器，但實(shí)際上只有人們最了解的種類(lèi)才便于進(jìn)行這種分子克隆的操作至今在海洋生物中用得較多的是微藻，已有藍(lán)

15、藻紅藻、綠藻和硅藻轉(zhuǎn)化成功，其中，藍(lán)藻分子生物學(xué)的研究近幾年來(lái)一直處于整個(gè)生物學(xué)的前沿。1994年我國(guó)和日本學(xué)者同年報(bào)道了在藍(lán)藻中表達(dá)藥物基因成功。十多年來(lái)中國(guó)科學(xué)院植物研究所與合作者們已在藍(lán)藻中成功地表達(dá)了6個(gè)藥物基因:人腫瘤壞死因子a、人表皮生長(zhǎng)因子、人尿激酶原、人小腸三葉因子、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人和小鼠的金屬硫蛋白；同時(shí)，還對(duì)載體的啟動(dòng)子、終止子、SD序列等調(diào)控因子作了研究，使外源基因表達(dá)效率從國(guó)際上平均為可溶性蛋白的千分之幾，提高到3.3%5%。從現(xiàn)有資料來(lái)看，海洋天然產(chǎn)物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上既具有較大程度的新穎性，又具有較為復(fù)雜的多樣性(不亞于陸生中藥成分)。這不僅說(shuō)明在物質(zhì)根底方面海洋

16、藥物與陸生中草藥有一定的共性，而且結(jié)構(gòu)新、活性強(qiáng)、毒性低的海洋天然產(chǎn)物可直接作為開(kāi)發(fā)新藥的先導(dǎo)化合物。雖如此，海洋藥物藥源問(wèn)題仍歷史性地被帶人21世紀(jì)。只有開(kāi)辟新的資源領(lǐng)域，探索新的方法和技術(shù)，實(shí)現(xiàn)技術(shù)上的跨越，才有可能解決制約海洋藥物產(chǎn)業(yè)化的瓶頸因素。就技術(shù)來(lái)說(shuō)，生物系統(tǒng)篩選技術(shù)、海洋化學(xué)生態(tài)學(xué)、海洋生物基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物組合化學(xué)等學(xué)科、方法和技術(shù)的開(kāi)展正是未來(lái)海洋藥物研究開(kāi)發(fā)實(shí)現(xiàn)技術(shù)跨越的基石?？v觀國(guó)內(nèi)外海洋生物活性物質(zhì)研究的成功范例，可以看出：資源學(xué)研究是根底；政府宏觀指導(dǎo)與參與、企業(yè)積極介入，以及廣闊海洋學(xué)、醫(yī)藥學(xué)科研工作者精誠(chéng)合作，使科研工程取得較大力度的支持，從而推動(dòng)研究工

17、作向縱深開(kāi)展。參考文獻(xiàn)【1】 郝方，張雪蓮，張順寶等. 生物技術(shù)在新藥研發(fā)中的進(jìn)展與展望. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志， 2005，27(2):142-143【2】 張成武，劉宇峰，王習(xí)霞等. 螺旋藻藻藍(lán)蛋白對(duì)人血癌細(xì)胞株HL260 ，K2562和U2937 的生長(zhǎng)影響 . 海洋科學(xué)，2000，24 (1) :45.【3】 吳梧桐，郭顯，王友同. 防治肝病的鱉魚(yú)肝刺激物質(zhì)及其制備方法. 中國(guó)創(chuàng)造專(zhuān)利，創(chuàng)造專(zhuān)利證書(shū):JL99114463.5，國(guó)家專(zhuān)利主分類(lèi)號(hào):COCK14-435【4】 郭昱，吳梧桐. 鱉肝肽對(duì)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用及免疫調(diào)節(jié)作用. 中國(guó)藥學(xué)雜志. 2001.1: 44-46【5】 龔寧波，張麗娟，古同男. 基因芯片技術(shù)在醫(yī)藥學(xué)研究中的應(yīng)用. 中南藥學(xué)，2005，3(1):35-37【6】 Scherf U，Ross DT，Waltham M，et al. A gene expression dadabase for the molecular pharmacology of cancer.Nat Genet，2000，24(3):236【7】 武瑞，連學(xué)昭. 基因芯片技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005.(1):21-23The Abstract of 5th Interna