實(shí)驗(yàn)一植物葉綠素含量測(cè)定-丙酮提取法

1、 實(shí)驗(yàn)一魚(yú)類回避脅迫實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馕廴疚锩{迫下魚(yú)類的回避行為。學(xué)會(huì)用魚(yú)類回避實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)水體污染物的方法。了解回避反應(yīng)的生理效應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理回避行為，是指水生動(dòng)物，特別是游泳能力強(qiáng)的水生動(dòng)物，能主動(dòng)避開(kāi)受污染的水區(qū)，游向未受污染的清潔水區(qū)的行為。有些化學(xué)物質(zhì)甚至利用化學(xué)分析儀器都難以檢測(cè)到，但通過(guò)回避試驗(yàn)，便能反映出水體的混合污染狀況的實(shí)際毒性。人們利用魚(yú)類的這種回避特性，設(shè)計(jì)控制不同濃度的污染區(qū)、非污染區(qū)（清水區(qū)）及污染混合區(qū)（污水與清水混合區(qū)）的模擬設(shè)施，借以檢定魚(yú)類的回避能力，對(duì)判定水污染狀況和工業(yè)廢水的處理程度，都有一定的實(shí)用價(jià)值。魚(yú)類回避反應(yīng)，是通過(guò)嗅覺(jué)、味覺(jué)、視覺(jué)，側(cè)線及其他感

2、受器而實(shí)現(xiàn)的。嗅覺(jué)器官可感受水中化學(xué)成分、食物及其他魚(yú)類皮膚分泌物等所引起的化學(xué)刺激，是引起魚(yú)類行為反應(yīng)的重要器官之一。味蕾是感覺(jué)器，廣泛分布于魚(yú)類的口腔、觸須及表皮等部位，對(duì)水中有些重金屬離子（如汞、銅、鋅等），具有很高的敏感性。當(dāng)環(huán)境中的污染物達(dá)到回避閾值時(shí)，就會(huì)引起魚(yú)類對(duì)外界環(huán)境刺激的行為反應(yīng)而出現(xiàn)的短期的逃避行為。因此，通過(guò)魚(yú)類這種短期的轉(zhuǎn)移與逃避可直觀地反應(yīng)環(huán)境中理化性質(zhì)的惡化、水的變質(zhì)等。三、試劑與材料試劑：0.22.0mg/LNH3水溶液材料：非洲鯽魚(yú)（Tilapiamossambic）為26.9克最宜。試驗(yàn)前先經(jīng)室內(nèi)馴養(yǎng)七天以上。馴養(yǎng)期間每天投喂豆餅粉。儀器與器皿：自制的魚(yú)類回

3、避槽。其結(jié)構(gòu)如圖所示。四、實(shí)驗(yàn)步驟在回避槽中裝入適量的清水，槽一端的污染區(qū)和對(duì)照區(qū)各放供試魚(yú)20條。在污染區(qū)中投加NH3,打開(kāi)閥門，觀察魚(yú)類是否逃避到回避槽另一端的混合區(qū)。如果沒(méi)有魚(yú)游走，繼續(xù)增加nh3的投加量，直到有第一條魚(yú)游到混合區(qū)。記錄此時(shí)nh3的投加量，即為最小效應(yīng)量。繼續(xù)增加NH3的投加量，并同時(shí)計(jì)算游到回避槽另一端混合區(qū)魚(yú)的數(shù)量。當(dāng)供試魚(yú)一半數(shù)量游到的回避槽另一端混合區(qū)時(shí)，記錄此時(shí)NH3的投加量，即為半數(shù)效應(yīng)量。實(shí)驗(yàn)記錄NH3的投加量對(duì)照區(qū)魚(yú)的數(shù)量污染區(qū)魚(yú)的數(shù)量混合區(qū)魚(yú)的數(shù)量回避率回避率的計(jì)算回避率率=對(duì)照區(qū)魚(yú)的數(shù)量一污染區(qū)魚(yú)的數(shù)量20五、思考題什么叫行為毒性？污染導(dǎo)致魚(yú)類回避行為

4、對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)有什么影響？在用魚(yú)類回避實(shí)驗(yàn)進(jìn)行化學(xué)物毒性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)注意什么問(wèn)題？實(shí)驗(yàn)二過(guò)氧化物酶活性(POD)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)定過(guò)氧化物酶。二、實(shí)驗(yàn)原理植物葉片在衰老過(guò)程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過(guò)程的變化。近來(lái)大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)。過(guò)剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的，活性較高的一

5、種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有密切關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測(cè)量這種酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)的代謝變化。在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm處有最大吸收，可用分光光度計(jì)測(cè)量470nm的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料植物葉試劑100mmol/L磷酸緩沖液pH6.0：取0.2mol/LNa2HP04,87.7ml與0.2mol/LNaHPO，12.3ml24混合。反應(yīng)混合液：100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28M，于磁力攪拌器上

6、加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過(guò)氧化氫19M,混合均勻，保存于冰箱中。(3)設(shè)備材料分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋，100mL容量瓶，吸管，離心機(jī)四、實(shí)驗(yàn)步驟稱取植物材料lg，剪碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，以400r/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，殘?jiān)儆?mL磷酸緩沖液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，貯于低溫下備用。取光徑lcm比色杯2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3mL,作為對(duì)照，另一只加入反應(yīng)混合液3mL和上述酶液1mL,(如酶活性過(guò)高可稀釋之)，立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，于分光光度計(jì)上測(cè)量波長(zhǎng)470nm下的吸光度值，每隔lmi

7、n讀數(shù)一次。四、結(jié)果計(jì)算以每分鐘內(nèi)吸光度變化值表示酶活性大小，即A470/ming(鮮重)表示之，也可以用每min內(nèi)厶A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位(u)表示。過(guò)氧化物酶活性u(píng)/(g.min)二冊(cè)減兀減忍式中：A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值的變化;W植物鮮重，g；t為反應(yīng)時(shí)間，min；VT為提取酶液總體積，mL；VS為測(cè)定時(shí)取用酶液體積，mL。五、思考題1、引起誤的原因2、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和討論 （2）645(3) 實(shí)驗(yàn)三植物葉綠素含量測(cè)定丙酮提取法高等植物光合作用過(guò)程中利用的光能是通過(guò)葉綠體色素（光合色素）吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠體色素的提取

8、、分離和測(cè)定是研究它們的特性以及在光合中作用的第一步。葉片葉綠素含量與光合作用密切相關(guān)，是反眏葉片生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需要測(cè)定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導(dǎo)作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夤夂仙氐囊恍┲匾砘再|(zhì)。明確光合色素的提取及分離方法。學(xué)會(huì)利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量的方法。實(shí)驗(yàn)原理葉綠素不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，可用多種有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對(duì)特定波長(zhǎng)的光有最大吸收，用分光光度計(jì)測(cè)定在該波長(zhǎng)下葉綠素溶液的吸光度（也稱為光密度），再根據(jù)葉綠素在該波長(zhǎng)下的吸收系數(shù)即可計(jì)

9、算葉綠素含量。利用分光光計(jì)測(cè)定葉綠素含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=Kbc式中：A為吸光度；K為吸光系數(shù)；b為溶液的厚度；c為溶液濃度。葉綠素a、b的丙酮溶液在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數(shù)（當(dāng)溶液厚度為1cm，葉綠素濃度為gL-i時(shí)的吸光度）分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)Lambert-Beer定律，葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度（A和A）與溶液中葉綠素a、b和

10、總濃度（C、C、C，單位為663645aba十bmgL-1）的關(guān)系可分別用下列方程式表示：A=82.04C+9.27CTOC o 1-5 h z663ab（1）A=16.76C+45.60C645ab解方程（1）和（2）得：C=12.7A2.59a663AA663C=22.9A4.67b645（4）C=20.3A+8.04a十b645A663（5）度，從公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要測(cè)得葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光就可計(jì)算出提取液中的葉綠素a、b濃度和葉綠素總濃度（a+b）。在652nm處，葉綠素a和b的吸光系數(shù)相同，因此提取液中葉綠素的總濃度（a+b）也可通過(guò)測(cè)定溶液

11、在波長(zhǎng)652nm處的吸光度（A）求得，其計(jì)算公式為：652C=34.5XAX1000（6）a十b652式中：34.5為葉綠素a和b在波長(zhǎng)652nm處的吸光系數(shù)。但I(xiàn)nskeep等（1985）認(rèn)為葉綠素a和b吸光系數(shù)相等時(shí)的波長(zhǎng)位于吸收光譜斜率很陡的位置上，因此儀器波長(zhǎng)很小的偏差都可能導(dǎo)致很大的測(cè)定誤差。所測(cè)定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可按下式進(jìn)行計(jì)算：葉綠素含量（mgg-1或mgdm-2）=CXV/AX1000（7）式中：C為葉綠素濃度（mgL-1）或mgdm-2）；V為提取液總體積（ml）；A為取樣鮮重（g）或取樣面積（dm-2）。三材料、儀器、藥品1材料：水稻、玉米、花生、桑樹(shù)等

12、植物的綠色葉片。2儀器：（1）分光光度計(jì)；（2）天平；3實(shí)驗(yàn)器皿：（1）研缽；（2）濾紙；（3）漏斗；（4）5ml移液管；（5）打孔器；（6）滴管；（7）剪刀；（8）25ml容量瓶；藥品：丙酮、石英砂、碳酸鈣四實(shí)驗(yàn)步驟取樣：用毛筆或毛刷清除葉片表面的灰塵，用打孔器從葉片上打取0.25dm-2的葉圓片，立即稱重，剪碎后放入研缽中。注意取樣時(shí)要避開(kāi)大的葉脈。2研磨提?。合蜓欣徶屑尤?0%丙酮2.5ml，以及少許CaCO3（中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素）和石英砂，研磨成勻漿，再加入3ml80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處?kù)o止35min后，用一層干濾紙過(guò)濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%

13、丙酮將研缽洗凈，清洗液也要過(guò)濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的周圍洗脫色素，待濾紙和殘?jiān)孔儼缀?，?0%丙酮定容至刻度。3.讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，（注意不要用手接觸比色皿的光面），先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時(shí)要使清洗液接觸比色皿內(nèi)壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中，液面高度約為比色皿高度的4/5，將撒在比色皿外面的溶液用濾紙吸掉（注意不能擦），再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內(nèi)。第一個(gè)位置放盛有80%丙酮的比色皿，做為空白對(duì)照。將儀器波長(zhǎng)分別調(diào)至663、645、652nm處，以80%丙酮做為空白對(duì)照調(diào)透光率10

14、0%，分別測(cè)定溶液在上述三個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度。（每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。注意，每次在轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)時(shí)，都要用80%丙酮調(diào)透光率100%）。結(jié)果計(jì)算：將645、663、652nm處測(cè)得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中計(jì)算葉綠素a、b濃度和總濃度。再將葉綠素a、b濃度和總濃度代入公式（7）中求出所測(cè)材料單位重量或單位面積的葉綠素a、b含量和總含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄1實(shí)驗(yàn)材料植物名稱：種植地點(diǎn)：取樣時(shí)間：取樣部位及數(shù)量：2數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果記載：表1測(cè)定數(shù)據(jù)記錄及計(jì)算結(jié)果重復(fù)光密度葉綠素含量mg/gFW或mg/dm2645nm652nm663nmCac.C(a+b)公式(5)C(a+b)公式(6)Ca

15、/Cb1綠23葉平均值標(biāo)準(zhǔn)差1黃23葉平均值標(biāo)準(zhǔn)差注：本實(shí)驗(yàn)中由于數(shù)值都來(lái)自同一樣品，所以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算只作為練習(xí)。思考題說(shuō)明葉綠素的生理意義以及葉綠素含量測(cè)定的重要性？為什么葉綠素提取液用80%丙酮而不用100%的丙酮？在用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取液的光密度時(shí)，為什么要用80%丙酮將儀器的透光率調(diào)到100%？如果用蒸餾水調(diào)100%對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)會(huì)有什么影響？葉片中的類胡蘿卜素和花色素是否影響葉綠素含量測(cè)定？為什么？如果你不知道葉綠素的吸收系數(shù)，但有葉綠素的純品，如何測(cè)定樣品中的葉綠素含量？注意事項(xiàng)1.測(cè)定葉綠素的分光光度計(jì)波長(zhǎng)和精度必須符合要求，否則測(cè)定結(jié)果不佳，導(dǎo)致在652nm測(cè)得的總量與

16、在663nm，645nm測(cè)定計(jì)算的總量差異明顯。提取葉綠素時(shí)應(yīng)避直射光，操作要迅速；提取出的葉綠素應(yīng)立即測(cè)定，以免光氧化使含量下降。丙酮為揮發(fā)性有機(jī)試劑，應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。實(shí)驗(yàn)四富營(yíng)養(yǎng)化水體中藻類形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)會(huì)采集、固定浮游生物水樣，并觀察浮游生物。2.了解富營(yíng)養(yǎng)化水體生境、藻類的特征，并認(rèn)識(shí)一些有指示作用和常見(jiàn)的種類。進(jìn)一步鞏固顯微鏡觀察和繪圖的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理富營(yíng)養(yǎng)化是指在人類活動(dòng)的影響下，生物所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)質(zhì)大量進(jìn)入湖泊、河口、海灣等緩流水體，引起藻類及及其他浮游生物迅速繁殖，水體溶解氧量下降，水質(zhì)惡化，魚(yú)類及其其他生物大量死亡的現(xiàn)象。中國(guó)富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)的一些藻類

17、優(yōu)勢(shì)種有微囊藻、魚(yú)腥藻、束絲藻、顫藻、直鏈藻、隱藻等。環(huán)境污染后，原有生物與環(huán)境多種物質(zhì)關(guān)系發(fā)生變化，出現(xiàn)新的環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)關(guān)系。耐污種在污染環(huán)境中增多，而敏感種逐漸消失，狹污性種群被廣污性種群所取代，群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此，浮游植物長(zhǎng)期以來(lái)就被用作水質(zhì)的指示生物，有些生物對(duì)有機(jī)污染物十分敏感。通過(guò)觀察水體中的浮游生物的種類和數(shù)量，可初步判斷水體是否富營(yíng)養(yǎng)化。三、實(shí)驗(yàn)試劑與材料試劑魯哥氏液：稱6g碘化鉀溶于20ml水中，溶解后加入4g碘，充分搖動(dòng)待碘完全溶解后再加80ml水。2.材料2m左右長(zhǎng)的竹竿，尼龍繩儀器與器皿顯微鏡、載玻片、蓋玻片、滴管、浮游生物網(wǎng)、塑料瓶（50ml）四、實(shí)驗(yàn)步驟

18、1.野外采樣在天然富營(yíng)養(yǎng)化水體，離岸邊1m以外地方，手持長(zhǎng)竹竿，將浮游生物網(wǎng)放入水面下0.5m處，作“8”字形擺動(dòng)，經(jīng)1020min后，提取浮游生物網(wǎng)，將網(wǎng)底控系的塑料瓶解下，將其濃集液搖勻一分為二，各分裝到另外的兩個(gè)塑料瓶?jī)?nèi)，其中一瓶不加藥液擰緊瓶蓋，另外的一瓶，按照15ml濃集液加0.4ml魯哥氏液和0.6ml甲醛的比例，滴加藥液，將浮游生物殺死固定，攜回室內(nèi)后，及時(shí)貼上標(biāo)簽，記錄采集地點(diǎn)、日期，并進(jìn)行定性觀察。未加藥液的瓶攜回室內(nèi)后要及時(shí)擰開(kāi)瓶蓋，以防藻類窒息、腐爛分解。室內(nèi)觀測(cè)用滴管吸取未加藥液的濃集水樣，將其滴在載片上12滴，再用另一滴管滴加12滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甲基纖維素液，用大頭

19、針輕輕混勻，盡可能少出氣泡，然后蓋好蓋玻片，放置在顯微鏡的低倍鏡下尋找藻類。找到后初步辨認(rèn)，將藻類移至視野中央，再轉(zhuǎn)換到高倍境下觀察，最好邊觀察邊繪圖，并在圖旁記下認(rèn)準(zhǔn)的藻類的一些特點(diǎn)，然后對(duì)照附錄一中的藻類圖譜，將其鑒定到一定分類階元。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄請(qǐng)將觀察到的浮游生物畫(huà)在下表并根據(jù)觀察到的特征和分類檢索表鑒定是何種藻類。要求最六、思考題1.控制水體的富營(yíng)養(yǎng)化有什么措施？2.你觀察到的富營(yíng)養(yǎng)化水體中浮游植物的優(yōu)勢(shì)種有哪些？實(shí)驗(yàn)五活性污泥中常見(jiàn)微生物形態(tài)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察水處理系統(tǒng)中活性污泥曝氣混合液中典型微生物的個(gè)體形態(tài)，學(xué)會(huì)生物圖的繪制。2.學(xué)會(huì)辨認(rèn)活性污泥中指示性原生動(dòng)物的形態(tài)特征

20、和判斷活性污泥的活性。二、實(shí)驗(yàn)原理活性污泥法曝氣池中的活性污泥是生物法處理廢水的工作主體。它們是由細(xì)菌、霉菌、酵母菌、放線菌、原生動(dòng)物等微生物意見(jiàn)后生動(dòng)物如輪蟲(chóng)、線蟲(chóng)等與廢水中的固體物質(zhì)所組成。在活性污泥系統(tǒng)中，細(xì)菌數(shù)量最多，分解有機(jī)物的能力最強(qiáng)，并且繁殖迅速，所以是污水生物處理的主體。細(xì)菌一般甚少以單體的形式存在，菌膠團(tuán)是活性污泥中細(xì)菌的主要存在形式。不同細(xì)菌形成不同的菌膠團(tuán)，有分枝狀的、垂絲狀的、球形的、橢圓形的、蘑菇形的以及各種不規(guī)則形狀的。菌膠團(tuán)是活性污泥法處理的主體。一般來(lái)說(shuō)，活性污泥性能的好壞，主要可根據(jù)所含菌膠團(tuán)多少、大小及結(jié)構(gòu)的緊密程度來(lái)定。新生菌膠團(tuán)顏色較淺，甚至無(wú)色透明，但

21、有旺盛的生命力，氧化分解有機(jī)物的能力強(qiáng)。老化的菌膠團(tuán)由于吸附了許多雜質(zhì)，顏色較深，看不到細(xì)菌單體，象一團(tuán)爛泥似的，生命力較差。當(dāng)遇到不適宜的環(huán)境時(shí)，菌膠團(tuán)就發(fā)生松散，甚至呈現(xiàn)單個(gè)游離細(xì)菌，影響處理效果。因此，為了使污水處理達(dá)到較好的效果，要求菌膠團(tuán)結(jié)構(gòu)緊密，吸附、沉降性能良好。其次則是原生動(dòng)物。原生動(dòng)物具有新陳代謝、運(yùn)動(dòng)、繁殖、對(duì)外界刺激的感應(yīng)性和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等生理功能。據(jù)報(bào)導(dǎo)，活性污泥中約存在著有228種原生動(dòng)物，原生動(dòng)物物種非常豐富，有變形蟲(chóng)、草履蟲(chóng)、漫游蟲(chóng)、裂口蟲(chóng)、有肋遁纖蟲(chóng)、鐘蟲(chóng)和殼吸管蟲(chóng)；還有微型后生動(dòng)物輪蟲(chóng)等。因?yàn)樵鷦?dòng)物個(gè)體比細(xì)菌大，生態(tài)特點(diǎn)也容易在顯微鏡下觀察，而且不同種類的

22、原生動(dòng)物都有各自所需的生存條件，所以哪一類原生動(dòng)物占優(yōu)勢(shì)，也就反映出相應(yīng)的水質(zhì)狀況。國(guó)內(nèi)外都把原生動(dòng)物當(dāng)做污水處理的指示性生物，并利用原生動(dòng)物的變化情況來(lái)了解污水處理效果及污水處理中運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。一般的規(guī)律是：在污水生化處理中，當(dāng)固著型的纖毛蟲(chóng)t蟲(chóng)、蓋纖蟲(chóng)、等枝蟲(chóng)等出現(xiàn)時(shí)，而且數(shù)量較多而又活躍，說(shuō)明污水處理效果良好，出水COD、BOD5較低（一般C0DW80mg/L,BOD5W30mg/L）,水質(zhì)清澈，可達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)。輪蟲(chóng)出現(xiàn)也反映出水水質(zhì)較好，水中有機(jī)物含量更低（一般CODW5Omg/L,BOD5W15mg/L）。當(dāng)曝氣池中溶解氧降低到1mg/L以下時(shí)，鐘蟲(chóng)生活不正常，體內(nèi)伸縮泡會(huì)脹得很

23、大，頂端突進(jìn)一個(gè)氣泡，蟲(chóng)體很快會(huì)死亡。當(dāng)污水處理中大量出現(xiàn)鞭毛蟲(chóng)和變形蟲(chóng)時(shí)，可指示污水處理效果不好，出水COD、BOD5較高，水質(zhì)渾濁。當(dāng)外界環(huán)境條件不適宜于生長(zhǎng)時(shí)，原生動(dòng)物能形成胞囊，胞囊是原生動(dòng)物抵抗不良外界環(huán)境的休眠體。為了正確判斷水質(zhì)及運(yùn)行參數(shù)改變的原因，生物相觀察中必須根據(jù)原生動(dòng)物的種群變化、數(shù)量多少及生長(zhǎng)活性三方面狀況綜合考察，否則，將產(chǎn)生片面的結(jié)論。例如，纖毛蟲(chóng)在環(huán)境適宜時(shí)，用裂殖方式進(jìn)行生殖；當(dāng)食物不足，或溶解氧、溫度、pH值不適宜，或者有毒物質(zhì)超過(guò)其忍受限度時(shí)，就變?yōu)榻雍仙?，甚至形成孢囊以保衛(wèi)其身體。所以當(dāng)觀察到纖毛蟲(chóng)活動(dòng)能力差，鐘蟲(chóng)類口盤(pán)縮進(jìn)、伸縮泡很大，細(xì)胞質(zhì)空泡化、活

24、動(dòng)力差、畸形、接合生殖、有大量孢囊形成等現(xiàn)象時(shí)，即使蟲(chóng)數(shù)較多，也說(shuō)明處理效果不好。三、實(shí)驗(yàn)儀器和材料l.顯微鏡、擦鏡紙、載玻片、蓋玻片、擱玻架等2活性污泥曝氣液四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1標(biāo)片的制作：取潔凈的載玻片、蓋玻片各一片，用小滴管取活性污泥混合液一小滴于載玻片中央（如混合液中污泥較少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴；如混合液中污泥較多，則應(yīng)稀釋后進(jìn)行觀察），蓋上蓋玻片，蓋玻片時(shí)應(yīng)使其已接觸水滴時(shí)才放下，否則會(huì)在片中形成較多氣泡，影響觀察。蓋玻片乳匚I載玻片實(shí)驗(yàn)圖-3壓滴法制作標(biāo)片示意圖2嚴(yán)格按光學(xué)顯微鏡的使用操作方法，分別在低倍、高倍鏡下觀察標(biāo)片，觀察菌膠團(tuán)、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物、藻類等微生物的形態(tài)，

25、用鉛筆繪出各種微生物的形態(tài)圖。3就觀察到的微生物與附錄二中的生物圖譜相對(duì)照，找出污水處理中典型的指示生物鐘蟲(chóng)和輪蟲(chóng)，并描述其活性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄（一）微生物形態(tài)的觀察請(qǐng)將觀察到的微生物及實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象記錄在下表中。1進(jìn)行微生物活體的觀察時(shí)，要使所觀察的目標(biāo)清晰，應(yīng)該如何調(diào)節(jié)光線？2請(qǐng)就你所觀察的微生物情況，評(píng)價(jià)活性污泥的活性。實(shí)驗(yàn)六蠶豆微核觀察對(duì)重金屬污染的指示一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解微核測(cè)試原理和其在毒理遺傳學(xué)上的意義。2通過(guò)實(shí)驗(yàn)，了解重金屬污染對(duì)植物種子萌發(fā)的抑制作用，學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測(cè)試技術(shù)。二.實(shí)驗(yàn)原理環(huán)境的三致性，即指環(huán)境對(duì)生物的致畸、致癌、致突變性，是目前環(huán)境污染中最主要的問(wèn)題。三致的根本在

26、于致突變，致畸、致癌常常是致突變的結(jié)果。微核是無(wú)著絲點(diǎn)的染色體斷片，在有絲分裂后期不能向兩極移動(dòng)，所以游離于細(xì)胞質(zhì)中，在間期細(xì)胞核形成時(shí)，即可在它附近看到一到幾個(gè)很小的圓形結(jié)構(gòu)，直徑大約是細(xì)胞直徑的1201/5,這就是微核（micronucleus）。微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一，指示染色體或紡錘體的損傷。由于這種損傷會(huì)因細(xì)胞受到的外界誘變因子的作用而加劇，而微核產(chǎn)生的數(shù)量又可與誘變因子劑量的強(qiáng)弱呈正比，因此可以用微核出現(xiàn)的頻率來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境誘變因子對(duì)生物遺傳物質(zhì)的損傷程度。各種類型的骨髓細(xì)胞中均能見(jiàn)到微核，但只有少量胞漿的有核細(xì)胞，其核是分葉而有突起的，這類分葉及突起常常被誤認(rèn)為是微核，容易造

27、成計(jì)算誤差。哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，在成熟過(guò)程中將細(xì)胞核排出，成為無(wú)核細(xì)胞，而微核卻留在細(xì)胞質(zhì)中不被排出。這樣，只要紅細(xì)胞生成過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)染色體斷片，就能在成熟的紅細(xì)胞內(nèi)看到微核，一目了然，即使沒(méi)有多少遺傳學(xué)知識(shí)的人，稍加訓(xùn)練也能從事這方面的計(jì)數(shù)工作。染色體斷裂實(shí)際上就是染色體的缺失。如果進(jìn)行染色體畸變分析，首先要做染色核型分析（包括正常和異常的）。染色體數(shù)目多，形狀小，則適于做核型分析的中間分裂相不易得到，而且核型分析時(shí)需要較好的遺傳學(xué)知識(shí)，還需要較豐富的經(jīng)驗(yàn)。與之比較，微核法是一種不需特殊試劑及設(shè)備，快速而簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。蠶豆（viciafaba）根尖微核試驗(yàn)在1986年已被中國(guó)環(huán)保局列為一種環(huán)

28、境生物測(cè)試的規(guī)范方法，它作為一種環(huán)境變異的檢測(cè)手段，在我國(guó)不少地區(qū)的環(huán)保部門和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)中都有廣泛的應(yīng)用。蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)與染色體畸變?cè)囼?yàn)同樣具有準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)便、有明顯劑量效應(yīng)關(guān)系、適合大批量樣品檢測(cè)等特點(diǎn)。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局也肯定了蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境突變性檢測(cè)中的作用，對(duì)許多環(huán)境致癌物都作了標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)，建立了龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)，并建議在全世界范圍內(nèi)推廣。三實(shí)驗(yàn)材料器材：光學(xué)顯微鏡、10ml試管、蠶豆發(fā)芽盒、洗瓶、鑷子、載玻片、蓋玻片、濾紙等。試劑及材料（1）60mg/LPb（NO3）2溶液（2）蠶豆種子（3）卡諾氏固定液：由3：1的乙醇和冰醋酸配制；（4）醋酸洋紅溶液；（九）0.5%醋酸

29、洋紅（AceioCarmine）染液TOC o 1-5 h z洋紅lg醋酸90ml蒸餾水110ml將90ml醋酸加入110ml蒸餾水煮沸，然后將火焰移去，立即加入1克洋紅，使之迅速冷卻過(guò)濾，加飽和氫氧化鐵（媒染劑）水溶液數(shù)滴，直到呈葡萄酒色。室溫保存。加鐵使洋紅沉淀于組織而著色。此染液室溫存放時(shí)間越長(zhǎng)效果越好，室溫保存。四實(shí)驗(yàn)步驟種子處理：將實(shí)驗(yàn)用蠶豆（松滋青皮豆）種子洗凈后放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25C下浸泡24小時(shí)，此間至少換水兩次，所換水應(yīng)25C預(yù)溫。種子吸脹后，用紗布松散包裹置瓷盤(pán)中，保持溫度，在25C溫箱中催芽1224小時(shí)，待初生根長(zhǎng)出23mm時(shí)，再取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的

30、瓷盤(pán)中，25C繼續(xù)催芽，經(jīng)約36-48小時(shí)，大部分初生根長(zhǎng)至12cm左右，根毛育良好，這時(shí)即可用來(lái)進(jìn)行檢測(cè)了。重金屬處理選68粒初生根生長(zhǎng)良好，根長(zhǎng)一致的種子，放入盛有60mg/LPb（NO3）2的培養(yǎng)皿中，被測(cè)液浸沒(méi)根尖即可。用蒸餾水處理為空白對(duì)照。25C下培養(yǎng)48小時(shí)。根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)處理后的種子用自來(lái)水或蒸餾水浸洗三次每次23分鐘。洗凈后再置入鋪有濕潤(rùn)濾紙的瓷盤(pán)中，25C下再恢復(fù)培養(yǎng)24小時(shí)。根尖細(xì)胞固定借助于物理方法或化學(xué)藥劑的作用，迅速透入組織和細(xì)胞將之殺死，并且使其結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物如：蛋白質(zhì)，脂肪，糖類以及核物質(zhì)與細(xì)胞器等，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上盡可能保持生活時(shí)的完整和真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)更易于染色，

31、可以較清楚的顯現(xiàn)細(xì)胞在生活時(shí)不易看清的結(jié)構(gòu)。固定時(shí)，用卡諾氏固定液約5毫升，用刀片或小剪刀切取經(jīng)過(guò)處理的長(zhǎng)約0.51厘米的根尖1020條，放入試管內(nèi)，用塞蓋緊，在室溫下固定224小時(shí)，固定液的用量為材料體積的15倍以上。固定后的根如不及時(shí)制片，可換入70%的乙醇溶液中置4冰箱中保存?zhèn)溆?。酸解酸解的作用是去除未固定的蛋白質(zhì),同時(shí)使胞間層的果膠類物質(zhì)解體，細(xì)胞分散而易于觀察。用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩次，每次5分鐘，吸凈蒸餾水，加入6mol/L的鹽酸2ml將幼根浸沒(méi)，室溫下酸解10分鐘，幼根軟化即可。染色壓片吸去鹽酸，用蒸餾水浸沒(méi)幼根三次每次12分鐘。最后浸于水中。制片前切取根尖分身組織放在載玻片

32、上縱橫切成幾段，分別放在2片載玻片上，覆以載玻片，用鑷子柄或鉛筆頭輕敲幾下，再用拇指用力下壓，注意不要使玻片移動(dòng)，分開(kāi)兩玻片，各滴上12滴醋酸洋紅染液，58分鐘后加上蓋玻片，注意不要有氣泡產(chǎn)生，用吸水紙吸去多余染液。鏡檢：低倍鏡（10倍）鏡檢后，選擇細(xì)胞分散均勻，細(xì)胞無(wú)損，染色良好的區(qū)域（也可在高倍鏡下觀察），每個(gè)處理觀察100個(gè)細(xì)胞，記下微核數(shù)（兩個(gè)處理分別記錄）。先用低倍鏡觀察，找到分散的，背景清晰的細(xì)胞區(qū)，而后轉(zhuǎn)換高倍鏡進(jìn)行檢查。鏡檢順序如每實(shí)驗(yàn)組制片3張。每片至少鏡檢20個(gè)視野，每個(gè)視野最多數(shù)計(jì)50分生組織細(xì)胞。在分生組織細(xì)胞中觀察微核。微核的標(biāo)準(zhǔn)：微核與主核分開(kāi)。主核的核膜是完整的；

33、微核與主核的顏色一致（轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)，觀察微核顏色變化是否與主核一致。區(qū)別細(xì)胞質(zhì)中的顆粒物與染料的殘?jiān)晃⒑硕嗍菆A形或橢圓形。大小為主核的1/5-1/20。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察細(xì)胞數(shù)與微核出現(xiàn)率，以手持記數(shù)器記數(shù)，每片記數(shù)于下表中。而后進(jìn)行計(jì)算。微核記載表制片編號(hào)正常細(xì)胞數(shù)產(chǎn)生微核細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)微核數(shù)微核率0123微核率的計(jì)算微核率0=微核數(shù)正常細(xì)胞數(shù)+產(chǎn)生微核細(xì)胞數(shù)1000六、思考題1微核試驗(yàn)在環(huán)境評(píng)價(jià)中有何意義？2有一種粉末狀的化學(xué)制劑，如何確定它是否有致突變的作用？3在一般良好的自然環(huán)境中，動(dòng)物或植物的細(xì)胞是否會(huì)出現(xiàn)微核？你為什么這樣認(rèn)為？附錄一淡水中常見(jiàn)藻類植物的鑒定1、淡水中常見(jiàn)藻類植物的分

34、門檢索表藻類植物在分類學(xué)上是復(fù)雜而多樣的一大類植物。按較通用的分類系統(tǒng)把藻類分為11個(gè)門。分門的主要依據(jù)是光合色素的主要種類和組成；貯藏物質(zhì)的性質(zhì)；細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)等。淡水藻類分門檢索表(不包括輪藻、紅藻和褐藻)(2)細(xì)胞無(wú)色素體和核。色素直接分散在原生質(zhì)中，大多呈藍(lán)綠色，有時(shí)呈橄欖綠色、淡紫色、淡玫瑰色；貯藏物主要為藍(lán)藻淀粉藍(lán)藻門(Cyanophpta)(1)細(xì)胞具色素體和核，貯藏物不是藍(lán)藻淀粉。3(4)細(xì)胞有硅質(zhì)的、由上下兩瓣套合的壁(殼)，殼上有左右對(duì)稱或輻射對(duì)稱的花紋硅藻門(Bacillariophyta)4(3)細(xì)胞壁無(wú)上述構(gòu)造。5(8)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)孢子具橫溝或縱溝或僅具縱溝，有背

35、腹之分。6(7)無(wú)細(xì)胞壁或細(xì)胞壁由一定數(shù)自的板片組成甲藻門(Parronhnta)7(6)無(wú)細(xì)胞壁或細(xì)胞壁下具板片，鞭毛多為偏頂生一一隱藻門(Crvntonhsta)8(5)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)孢子不具橫溝和縱溝，無(wú)背腹之分。9(12)色素體呈綠色，很少為無(wú)色或灰色；貯藏物質(zhì)為淀粉或裸藻淀粉。(1)貯藏物質(zhì)為淀粉；植物體的體型多種多樣單細(xì)胞、群體、絲狀或薄壁組織狀；運(yùn)動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)抱子具2條(少數(shù)具4條或8條)等長(zhǎng)的鞭毛一一綠藻門(Chorophyta)(10)貯藏物質(zhì)為裸藻淀粉；植物體多為單細(xì)胞，少數(shù)為群體。色素體呈綠色，有時(shí)無(wú)色，運(yùn)動(dòng)細(xì)胞多具頂生鞭毛(極少數(shù)有2條或3條)裸藻門(Euglenop

36、hyta)12(9)色素體呈黃綠色、金褐色或淡棕黃色；貯藏物質(zhì)為白糖素或油。呈單細(xì)胞或群體；運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具1，2，3條等長(zhǎng)或不等長(zhǎng)的鞭毛。13(14)色素體呈金褐色或淡棕色；細(xì)胞大多裸露，有時(shí)具鱗片、小刺或囊殼；單細(xì)胞或群體；運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具1或2條等長(zhǎng)或不等長(zhǎng)的鞭毛，罕見(jiàn)具3條鞭毛或具偽足金藻門14(13)色素體呈黃綠色；植物體單細(xì)胞、群體或絲狀；運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具2條不等長(zhǎng)的鞭毛；單細(xì)胞或群體種類的細(xì)胞壁常由兩瓣套合而成；絲狀種類的細(xì)胞壁由兩個(gè)H形的節(jié)片組成，不具花紋黃藻門1.藍(lán)藻門的常見(jiàn)藻類圖11、湖生束球藻2、不定腔球藻2圖21.優(yōu)美平裂藻2.高山立方藻圖41、水華微囊藻2、束縛色球藻圖5眼狀針枝藻圖2

37、1、優(yōu)美平裂藻2、高山立方藻圖5眼狀真枝藻網(wǎng)61.詵氏膠狽族2.漳浮圖31、針狀藍(lán)纖維藻2、針晶藍(lán)纖維藻3、線形棒條藻圖61、饒氏膠須藻2、漂浮膠刺藻2圖101.沼地微鞘藻2一隱絲水鞘藻圖71、中華雙尖藻2、中華尖頭藻3、彎形尖頭藻圖101、沼地微鞘藻2、隱絲水鞘藻圖81.托馬織線藻2.小單歧藻11柔嫩徵毛漠圖81、托馬織線藻2、小單歧藻圖91大螺疑藻2.小頭藻3.紙形席藻4.大型帯絲藻圖91、大螺旋藻2、小顫藻3、紙形席藻4、大型鞘絲藻圖11柔嫩微毛藻圖121.靜水柱抱藻2.阿氏項(xiàng)圈藻2圖13水花束絲藻1.群體2漢絲圖13水花束絲藻生圖21誘豔|2翔魚(yú)眾3.040，.類蕪魚(yú)鶴-161一假絲狀

38、徵龔漠2.鎘綠徴囊饌3-具緣徹囊漢也不定徵囊藩161、假絲狀微囊藻2、銅綠微囊藻3、具緣微圖141、多變魚(yú)腥藻2、螺旋魚(yú)腥藻3、固氮魚(yú)腥藻4、類顫藻魚(yú)腥gsswCDCDCOCOCD00O)CDCD00aXDOQODCDCD(D(i)coa)a)a)CDODfflcda)wda?a?200880000800800800800888OOOOOOOOSSooOOooOOooooOOooooOO38888囊藻4、不定微囊藻ffllT1.為首螺謹(jǐn)漠2.飩頂爍譴藻3.方胞螺謹(jǐn)漠.極大螺施蒸舅家華平裂藻2-微小平裂藻“形平裂藻仁銀灰平2圖201.窩形席漢2.小席藻3.蜂巢席藻4.層理席藻5.皮狀席藻圖181

39、.清凈顫藻2悅目顫藻3.燦雄顫藻4.阿氏顫藻圖181、清凈顫藻2、悅目顫藻3、燦爛顫藻4、阿氏顫藻圖201、窩形席藻2、小席藻3、蜂巢席藻4、層理席藻5、皮狀席藻2、綠藻門常見(jiàn)的藻類圖11、素衣藻2、長(zhǎng)綠梭藻3、萊哈衣藻圖4葡萄藻4、中華葉衣藻圖21、雜球藻2、空球藻3、實(shí)球藻圖51、鐮形纖維藻2、擬新月藻4、美麗團(tuán)藻圖31、水溪綠球藻2、多芒藻3、粗刺藻3圖61、群星藻2、四球藻3、四月藻4、集星藻圖7美麗膠網(wǎng)藻9-3圖101、四角十字藻2、十字藻3、華美十字藻31圖111、網(wǎng)狀空星藻2、空星藻3、長(zhǎng)鼻空星藻圖81、水網(wǎng)藻2、短棘盤(pán)星藻圖91、彎曲柵藻2、彎曲柵藻扁盤(pán)變種3、斜生柵藻4、二形

40、柵藻5、尖細(xì)柵藻圖121、寡枝剛毛藻2、疏枝剛毛藻3、縐剛毛藻圖131、顫絲藻2、交錯(cuò)絲藻3、多形絲藻6、爪哇柵藻2圖141、長(zhǎng)毛毛枝藻2、夏毛枝藻3、叢枝毛枝藻圖171、偽四角角星鼓藻2-4、珍珠角星鼓藻5、多形角星鼓藻6、哈博角星鼓藻7、六刺角星鼓藻圖151、美貌水綿2、假顆粒水綿3、河北水綿1、具角鼓藻2、雙漿鼓藻3、矮型鼓藻圖18圖161、光角星鼓藻2、短棘角星鼓藻3、鈍角星鼓藻4、贊布角星鼓藻3、裸藻門常見(jiàn)的藻類圖2光滑壺藻圖51-2、廣卵異鞭藻3-4、內(nèi)管藻圖藻3Q嘰3/纖細(xì)裸藻2、三星裸藻雪、血紅裸4、魚(yú)形裸藻5、圖91、刺魚(yú)狀裸藻2、三梭裸藻3、旋紋裸藻4、尖尾裸藻5、梭形裸藻6、密盤(pán)裸藻圖101、桃形扁裸藻2、奇形扁裸藻3、粒形扁裸藻4、啞鈴扁裸藻5、尖尾扁裸藻圖71、靜裸藻2、異變裸藻3、近軸裸藻4、帶形裸藻5、中型裸藻圖81、敏捷扁裸藻2、彎曲扁裸藻3、多養(yǎng)扁裸藻4、圓柱形扁裸藻圖111、爪形扁裸藻2、波形扁裸藻3、鉤狀扁裸藻4、琵鷺扁裸藻圖151、網(wǎng)紋囊裸藻2、螺肋囊裸藻圖121、扭曲扁裸藻2、旋形扁裸藻圖131、梨形扁裸藻2、具瘤扁裸藻3、具刺扁裸藻圖141、旋轉(zhuǎn)囊裸藻2、旋轉(zhuǎn)囊裸藻