蛋白濃縮方法

1、蛋白濃縮方法基本有： 丙酮沉淀法；免疫沉淀法；三氯醋酸沉淀法；硫酸銨沉淀法；（低溫）有機(jī)溶劑沉淀法；聚乙二醇沉淀法；超濾法；透析法；離子交換層析和冷凍干燥法 1，丙酮沉淀法；三氯醋酸沉淀法試驗(yàn)要求的儀器簡(jiǎn)單，但是常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 2，免疫沉淀法：得有特異性抗體！ 3，硫酸銨沉淀法：利用高濃度鹽將蛋白質(zhì)析出（鹽析） 選擇硫酸按是因?yàn)椋蝴}析有效性，pH范圍廣，溶解度高，溶液散熱少，經(jīng)濟(jì)！ 4，（低溫）有機(jī)溶劑沉淀法：強(qiáng)調(diào)低溫（0-4度以下）是因?yàn)?0度時(shí)蛋白會(huì)在有機(jī)溶劑中變性，可用乙醇，丙酮注意：Mg2+離子，pH值 5，聚乙二醇沉淀法：使用PEG時(shí)旨在個(gè)別情況下才會(huì)是蛋白質(zhì)稍有變性！他溶解是

2、散熱低，形成沉淀的平衡時(shí)間短，通常達(dá)到30%時(shí)蛋白質(zhì)就會(huì)達(dá)到最大量的沉淀！ 6，超濾法：主要針對(duì)小體積蛋白質(zhì)溶液（幾ml）此法更不易引起變性！不過(guò)得有濃縮器，不是哪個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有的！ 7，透析法：主要用于更換蛋白質(zhì)的緩沖液！的有透析袋！不需要特殊的儀器！ 8，離子交換層析：可用陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行濃縮！ 9，冷凍干燥法：在冷凍狀態(tài)下讓揚(yáng)品種的液體升華蛋白質(zhì)特性與分離純化技術(shù)的選擇摘要：蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的物理、化學(xué)、生物化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，綜述了不同蛋白質(zhì)之間的性質(zhì)存在差異或者改變條件是使之具有差異，利用一種同時(shí)多種性質(zhì)差異，在兼顧收率和純度的情況下，選擇蛋白質(zhì)提純

3、的方法。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 分離純化前言 蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有成千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)，但對(duì)任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序來(lái)獲取高純度的制品。 蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是設(shè)法增加制品純度或比活性，對(duì)純化的要求是以合理的效率、速度、收率和純度，將需要蛋白質(zhì)從細(xì)胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來(lái)，同時(shí)仍保留有這種多肽的生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。 能從成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因，是不同

4、的蛋白質(zhì)在它們的許多物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)有著極大的不同，這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸的序列和數(shù)目不同造成的，連接在多肽主鏈上氨基酸殘基可是荷正電的、荷負(fù)電的、極性的或非極性的、親水的或疏水的，此外多肽可折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（螺旋、折疊和各種轉(zhuǎn)角）、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況，利用待分離的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)的差異，即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級(jí)分離步驟。 可依據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對(duì)應(yīng)的方法將蛋白質(zhì)混合物分離：1分子大小 不同種類的蛋白質(zhì)在分子大小方面有一定的差別，可用一些簡(jiǎn)便的方法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。11透析和超濾 透析在

5、純化中極為常用，可除去鹽類（脫鹽及置換緩沖液）、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險(xiǎn)，在純化中極為常用，可除去鹽類、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色12離心分離置換緩沖液 許多酶富集于某一細(xì)胞器內(nèi)，勻漿后離心得得到某一亞細(xì)胞成分，使酶富集1020倍，再對(duì)特定的酶進(jìn)行純化。差速離心，分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法，如離心時(shí)間太長(zhǎng)所有的物質(zhì)都會(huì)沉淀下來(lái)，故需選擇最佳分離時(shí)間，可得到相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分用于進(jìn)一步純化，避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問(wèn)題，但容量較小，只能用于少量制備。等密度梯度離心

6、常用的離主介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等等13凝膠過(guò)濾 這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一，注意使要離的蛋白質(zhì)分子量落在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。2形狀 蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液運(yùn)動(dòng)時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆粒或電泳凝膠中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到形狀的影響：對(duì)兩種相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)而言，球狀蛋白質(zhì)具有較小的有效半徑（斯托克半徑），通過(guò)溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力小，沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)大；反之，在體積排阻色譜時(shí)，斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散進(jìn)入凝膠過(guò)濾填料顆粒內(nèi)部，較遲洗脫出來(lái)，因而顯得比其它形狀

7、的蛋白質(zhì)要小。3溶解度 利用蛋白質(zhì)的溶解度的差別來(lái)分別各種蛋白質(zhì)常用的方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度，但在同一的特定外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度31pH控制和等電點(diǎn)沉淀 蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不易溶解。32蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析33有機(jī)溶劑分級(jí)法 蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（10g/ml）直至極易溶解（300mg/ml）不等。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑的極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，故控制有機(jī)溶劑的濃度

8、可分離蛋白質(zhì)。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。34溫度 不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，故分離操作一般在0或更低溫度下進(jìn)行。4電荷 蛋白質(zhì)凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負(fù)電荷的總和，如中性溶液中帶凈負(fù)電荷則稱為酸性蛋白質(zhì)，41電泳 不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段，而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的方法。 等電聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差異就能分開(kāi)。 2D分離蛋白質(zhì)分辨率已經(jīng)發(fā)展到100000個(gè)蛋白點(diǎn)。42離子交換層析 改變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、pH和（陰、陽(yáng)）離子交換填料，不同蛋白質(zhì)對(duì)不同的離子交

9、換填料的吸附容量不同，蛋白質(zhì)因吸附容量不同或不被吸附而分離。 洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變，也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫，后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫?？刂葡疵搫┑捏w積（與柱床體體積相比）、鹽濃度和pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來(lái)。 蛋白分子暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，故在一定的PH值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同5電荷分布 電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質(zhì)的表面，既可以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度與陽(yáng)離子交換柱結(jié)合也能以適當(dāng)強(qiáng)度與陰離子結(jié)合，因多數(shù)蛋白質(zhì)都有不能在單一的溶劑

10、條件下同時(shí)與兩種類型的離子交換柱結(jié)合，故可得用此性質(zhì)純化；電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布，使某一區(qū)域帶強(qiáng)正電荷而另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷，呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性，只能在極端pH與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，如鈣調(diào)蛋白只能在pH2時(shí)與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。6疏水性 多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些在表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來(lái)進(jìn)行分離的能力。 因其廉價(jià)和純化后的蛋白質(zhì)具有生物活性，是一種通用性的分離和純化蛋白質(zhì)的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀

11、分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的治療蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。7密度 多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.31.4g/cm3之間，分級(jí)分離蛋白質(zhì)時(shí)一般不常用此性質(zhì)，不過(guò)對(duì)含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密度上明顯不同，可用密度梯度法離心與大部分蛋白質(zhì)分離。8基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記 通過(guò)改變 cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。81GST融合載體 使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathi

12、one Sepharose 4B作親和純化，再利用凝血酶或因子X(jué)a切開(kāi)。82蛋白A融合載體 使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose純化。83含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）Chelating Sepharose 最通行的標(biāo)記之一，是在蛋白質(zhì)的氨基端加上610個(gè)組氨酸，在一般或變性條件（如8M尿素）下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑洗脫，或?qū)H降至5.9使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以純化。 重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或可溶產(chǎn)物，擴(kuò)張床吸附技術(shù)STREAMLINE適合做粗分離

13、。9親和能力 結(jié)合效率高，分離速度快的特點(diǎn)。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體、 吸附后可改變緩沖液的離子強(qiáng)度和PH的方法，洗耳恭聽(tīng)脫下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫親和層析固定相的配基與生物分子之間的特殊的生物大分子親和能力不同來(lái)進(jìn)行相互分離的，依親和選擇性的高低分為：基團(tuán)性親和層析，固定相上的配基對(duì)一類基團(tuán)的極強(qiáng)的親和力。如含有糖基的一類蛋白質(zhì)或糖蛋白對(duì)三嗪染料顯示特別強(qiáng)的吸附能力；高選擇性（專一性）親和層析，配基僅對(duì)某一種蛋白質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性。如單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keywor

14、d=克隆 克隆抗體對(duì)抗原的特異性的吸附。 親和層析除特異性的吸附外，仍然會(huì)因分子的錯(cuò)誤認(rèn)別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質(zhì)，另洗脫過(guò)程中的配體不可避免的脫落進(jìn)入分離體系。 與超濾結(jié)合起來(lái)，將兩者優(yōu)點(diǎn)集中形成超濾親和純化，具有高分離效率和大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，適用于初分離。按配基的不同可分為：（1）金屬螯合介質(zhì) 過(guò)渡金屬離子Cu2、Zn2和Ni 2等以亞胺絡(luò)合物的形式鍵合到因定相上，由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價(jià)鍵，從而形成了亞胺金屬蛋白螯合物，使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個(gè)組氨酸和半胱氨酸解離常數(shù)所控制，從而亦受

15、流動(dòng)相的pH和溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離。（2）小配體親和介質(zhì) 配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴氨酸等等。（3）抗體親和介質(zhì) 即免疫親和層析，配體有重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G專一，蛋白G能結(jié)合更多不同源的IgG。（4）顏料親和介質(zhì) 染料層析的效果除主要取決于染料配基與酶的親和力大小外，還與洗脫緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、PH值及待分離的樣品的純度有關(guān)。配體有Cibacron Blue和Procion Red兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起陽(yáng)離子交換劑的作用，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，最好要離子強(qiáng)度小于0。1和PH大于7時(shí)操作。（5）外源凝集素親和介

16、質(zhì) 配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固相外源凝集素能和數(shù)種糖類殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適合純化多糖、糖蛋白。10非極性基團(tuán)之間作用力 溶質(zhì)分子中的非極性基團(tuán)與非極性固定相間的相互作用力（非選擇性分散力或倫敦力）大小與溶質(zhì)分子極性基團(tuán)與流動(dòng)力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進(jìn)行分離。因其流動(dòng)相中的置換劑是極性小于水的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃等），這些有機(jī)溶劑可能使許多蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不可逆的變性；流動(dòng)相中須有離子對(duì)試劑（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分離有效地進(jìn)行和獲得高的質(zhì)量回收率；分離須在酸性介質(zhì)中進(jìn)行（一般pH在23之間），又有一些蛋白質(zhì)會(huì)在后兩種條件下產(chǎn)生

17、不可逆的分子構(gòu)象變化，故在生物大分子中人分離純化中受到限制，但分子構(gòu)象變化可逆的蛋白質(zhì)而言是有效的方法。 正相色譜在生物大分子中的分離和純化中應(yīng)用相對(duì)較少，因所用的溶劑很貴。11可逆性締合 在某些溶液條件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)行分級(jí)分離。12穩(wěn)定性121熱穩(wěn)定性 大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到95時(shí)會(huì)解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分離開(kāi)。122蛋白酶解穩(wěn)定性用蛋白酶處理上清液，消化雜蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白質(zhì)。13分配系數(shù)即利用雙水相萃取分離，常

18、用的生物物質(zhì)分離體系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對(duì)酶無(wú)毒性、分離設(shè)備與化學(xué)工業(yè)通用等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無(wú)機(jī)鹽種類等因素影響，發(fā)展：具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術(shù)。 雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化 一些與水混合多聚物的不相溶性導(dǎo)致依賴于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的液-液分配技術(shù)，可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種鹽，用于從微生物勻漿中除支細(xì)胞碎片、后續(xù)分配步驟進(jìn)一步純化。分離的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。14表面活

19、性141泡沫分離 蛋白質(zhì)溶液具有表面活性，氣體在溶液中鼓泡，氣泡與液相主體分離，在塔頂富集，達(dá)到分離和濃縮的目的。142反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法 反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法是80年代興起的一種新型分離技術(shù)，它利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反向膠團(tuán)（反膠團(tuán)），在一定條件下將水溶性蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核（水池）中，再創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，達(dá)到分離和提純蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)中的蛋白質(zhì)分子受到周?chē)肿雍捅砻婊钚詣O性頭的保護(hù)，仍保持一定的活性，甚至表現(xiàn)出超活性。由于蛋白質(zhì)增溶于反膠團(tuán)與蛋白質(zhì)所帶電荷及反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用及反膠團(tuán)的大小有關(guān)，因而表面活性劑的種類、水溶

20、液的pH值及離子強(qiáng)度等因素均影響反膠團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道利用AOT異辛烷反膠團(tuán)對(duì) HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=酵母 酵母脂肪酶進(jìn)行相轉(zhuǎn)移。143聚合物-鹽-水液-固苯取體系是90年代在國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)的種新的萃取體系，成功地用于萃取金屬離子及卞果酸脫氫酶等生物活性物質(zhì)較強(qiáng)的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接傾出液相即可使液固的相分離，勿需特殊技術(shù)處理，不用有機(jī)溶劑，無(wú)毒性，成相聚合物及鹽對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定和保護(hù)作用，萃取分離選擇性好消耗低、易于規(guī)模放大的分離生隊(duì)物活件物質(zhì)的新技術(shù)在聚乙二醇修飾物的聚乙二醇葡聚糖雙水

21、相萃取體系共價(jià)作用：主要用于含巰基酶的純化，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在層析介質(zhì)上，偶聯(lián)是可逆的，能還原二硫鍵的低分子化合物洗脫，如空間位阻，可在含變性劑的緩沖液時(shí)吸附，如已含二硫鍵，則先用還原劑打開(kāi)。實(shí)驗(yàn)89 酶的提取、分離、純化及其活性測(cè)定BIOX.CN 時(shí)間：2007-1-6來(lái)源：生命經(jīng)緯實(shí)驗(yàn)89 酶的提取、分離、純化及其活性測(cè)定原理酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒(méi)有酶的催化反應(yīng)，植物的生命也就停止了，因此對(duì)酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來(lái)，加以分離、純化，不同的研究目的對(duì)酶制劑的純度要求也不相同，有

22、些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對(duì)待。在酶的提取和純化過(guò)程中，自始至終都需要測(cè)定酶的活性，通過(guò)酶活性的測(cè)定以監(jiān)測(cè)酶的去向。酶的提取從高等植物中提取酶常遇到一些實(shí)際問(wèn)題，首先是細(xì)胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，提取時(shí)都應(yīng)區(qū)別對(duì)待，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，只要將細(xì)胞破碎，酶就會(huì)轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞

23、壁、細(xì)胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時(shí)如僅僅破碎細(xì)胞還不夠，還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來(lái)。其次，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì)，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時(shí)，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來(lái)，進(jìn)入提取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強(qiáng)的氫鍵，不能為一般的實(shí)驗(yàn)方法，如透析和凝膠過(guò)濾所解離。酚易氧化產(chǎn)生醌，醌為一種強(qiáng)氧化劑，會(huì)使蛋白質(zhì)的功能團(tuán)發(fā)生氧化或發(fā)生聚合，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團(tuán)，如SH，NH2，通過(guò)1，4加成反應(yīng)而發(fā)生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生棕色，以致影響酶活性的測(cè)定。因此如果沒(méi)有特殊需

24、要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過(guò)程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，因?yàn)樵诟遬H值時(shí)，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化，同時(shí)降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已經(jīng)知道PVP能與游離酚羥基形成強(qiáng)的氫鍵復(fù)合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時(shí)加入可溶性PVP，提取可溶性酶時(shí)加入不溶性交聯(lián)PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，簡(jiǎn)稱PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP

25、單體，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用。M_植物細(xì)胞有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，需要強(qiáng)烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動(dòng)勻漿器。為減低研磨或勻漿過(guò)程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘?jiān)偬崛∫淮巍Ｌ崛驖{時(shí)加入酚類結(jié)合劑PVPP，金屬螯合劑Na2EDTA，以及SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X100，以增加蛋白質(zhì)的可溶度，常用于與膜脂結(jié)合的酶?？傊?，可以通過(guò)試驗(yàn)以確定提

26、取蛋白質(zhì)的最佳條件。 分離和純化酶的分離和純化包括兩方面的工作；一是將含酶的提取液從很大體積濃縮到比較小的體積；另一方面是將酶制劑中大量的雜蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)分離除去。在分離提純過(guò)程中始終需要測(cè)定酶的活性和蛋白質(zhì)含量，以酶總活性的回收來(lái)判明提純過(guò)程中酶的損失情況，以比活性的提高程度來(lái)確定提純方法的有效性。一個(gè)好的提純步驟應(yīng)該是總活性的回收率高，比活性提高的倍數(shù)也較大，但實(shí)際上兩者往往難以兼顧。因而可在比活性多提高一些和總活性多回收一些之間，作出適當(dāng)?shù)倪x擇。上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶

27、蛋白，目前常用的方法有鹽析法，往層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級(jí)鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。大多數(shù)酶的活性存在于35梍45%和45梍55%飽和度硫酸銨沉淀的部分，但也有存在于65梍80%飽和度的（如花椰菜根的過(guò)氧化物酶）。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過(guò)濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過(guò)柱