波爾山羊FSHβ基因部分序列的測定及分析

1、PAGE 4PAGE 3波爾山羊FSH基因部分序列的測定及分析李利 張紅平 吳登?。ㄋ拇ㄞr(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，雅安625014）摘要：利用牛、綿羊等家畜FSH亞基基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR法擴(kuò)增并測定了2只波爾山羊FSH基因部分序列。結(jié)果表明測定出的FSH基因731bp序列中，包含外顯子1全序列（1bp61bp），第1內(nèi)含子全序列（62bp702bp）以及外顯子2的部分序列（703bp731bp），A、C、G、T四種堿基含量分別為34.47%，16.01%，17.92%和31.60%， A+T含量（66.07%）極顯著高于G+C的含量（33.93%），表明FSH基因在動物基因組中處于貧GC區(qū)

2、域。所測定的2條序列中，沒有檢出堿基突變，也沒有出現(xiàn)插入和缺失的現(xiàn)象。關(guān)鍵詞：波爾山羊，F(xiàn)SH基因，序列分析卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，它通過血液循環(huán)到達(dá)性腺和其它組織，與LH一起促進(jìn)動物性成熟和保持周期性的繁殖能力1。畜牧業(yè)生產(chǎn)上，F(xiàn)SH常用于家畜的同期發(fā)情和超數(shù)排卵以及繁殖疾病治療。哺乳動物卵泡刺激素一般由和兩個(gè)亞基組成，同一個(gè)體的亞基為卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）、促甲狀腺素（TSH）和促性腺素（CG）四種糖蛋白激素共有，而亞基決定激素的特異生物學(xué)功能2。缺失FSH基因的雌性小鼠由于卵泡

3、發(fā)育受阻而不育，雄性小鼠可育但睪丸較小并且精液量減少75%3。在豬、綿羊、牛和鼠等動物中FSH基因的研究比較深入，而在山羊方面只有FSH基因mRNA序列（AY156689）的結(jié)果報(bào)道。波爾山羊（Boer）原產(chǎn)于南非，是目前世界上最著名的肉用山羊品種，其繁殖性能也較強(qiáng)。我國最初于1995引入該品種，廣泛用于國內(nèi)地方山羊品種的雜交改良4。本研究采用波爾山羊（2只）為研究材料，測定該品種FSH基因部分序列，為進(jìn)一步研究山羊繁殖性能的遺傳機(jī)理積累科學(xué)資料。1材料和方法1.1樣品采集和DNA提取波爾山羊血樣（2份）采自四川成都龍泉波爾山羊種羊場，每只羊頸靜脈采血2毫升，與凍存管中的DNA保存液按1：1混

4、合均勻后-20低溫保存。血樣基因組DNA的提取參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南5，用酚/酚：氯仿（1：1）/氯仿：異戊醇（24：1）抽提，異丙醇沉淀，超純水溶解，-20保存。1.2 DNA擴(kuò)增和純化、序列測定1.2.1 PCR引物 引物設(shè)計(jì)參照牛（M83753）、水牛（AY449463）、綿羊（S64745）的FSH基因序列，擴(kuò)增目的基因片段的上、下游引物分別為5- ACAGCTTTCCCCAGACAAGG- 3， 5- AAGCAGAAC TGGATGGAC- 3 。引物序列由上海生物工程公司合成。1.2.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 PCR總反應(yīng)體系25L，基本組成如下：上、下游引物(10pmol/L

5、) 各1L，TaKaRa LA Taq（5U/L）0.25 L，dNTP Mixture(2.5mmol/L each) 4L，10LA Buffer （Mg2+ free）2.5L，MgCl2(25 mmol/L) 2.5L，DNA模板24L，最后用滅菌雙蒸去離子水補(bǔ)足25L總體積。PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性1min，98變性10sec，57.5退火1min，72延伸2min, 30個(gè)循環(huán)，最后72再延伸5min。PCR產(chǎn)物采用上海生物工程公司生產(chǎn)的小量柱式膠回收試劑盒回收。1.2.3目的片段DNA序列測定 測序反應(yīng)使用PE/ABI公司的BigDyeTM Terminator Cycle S

6、equencing Kit，按推薦的反應(yīng)體系完成。測序反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇/醋酸鈉純化，ABI3100測序(在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)。1.3 數(shù)據(jù)分析處理所有序列使用BioEdit Version5.06進(jìn)行人工輔助校對。2試驗(yàn)結(jié)果及分析2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠，電壓100V電泳檢測，在750bp左右出現(xiàn)一條清晰的DNA帶（圖1）。M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果2.2 序列測定結(jié)果及分析在測定出的總長度731bp的片段中，參照綿羊（S64745）和牛（M83753，AY449463）FSH基

7、因結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子序列，判定并分離出波爾山羊FSH基因部分序列包含：外顯子1的全序列（1bp61bp），第1內(nèi)含子全序列（62bp702bp）以及外顯子2的部分序列（703bp731bp）。在整個(gè)測定出的序列中，A、C、G、T的含量分別為34.47%、16.01%、17.92%和31.60%，其A+T含量（66.07%）極顯著高于G+C的含量（33.93%）。第1內(nèi)含子的上、下游剪切位點(diǎn)分別是GT和AG，因此它是GT-AG型內(nèi)含子。第1內(nèi)含子的各種堿基含量分別為 A（35.73%），C（13.88%），G（17.47%），T（32.92%），其G+C含量（31.36%）不到A+T含量（68.64%

8、）的一半。所測定的2條序列中，沒有檢出堿基突變,也沒有出現(xiàn)插入和缺失的現(xiàn)象。1 ACAGCTTTCC CCAGACAAGG CAGCTGTCTC AGGAAGTCTC AGCATCCACA GTTACCAAGT 61 GGTGAGTTAC TTCTGCATTC GCAGATTTTT AAGGATCTAG AGAACAAATT TAGAGCTTTT 121 TAACTTCTAT CGTATAGGGA ATCTGTGCTT TTCAACCTGG CTTCTTAAAT ACACTGTAAT 181 CAATGTTAGC AAGCAATTGA CTTTATATAG ATCAATTCAT CTGGCCT

9、CTG AAATAGTCTC 241 ATTTTAAACA AAGGGGGGCA AAAGCAAATG ATAACATTTA TGAGATGCTA AGAATGATGA 301 ACTAATTTTG TAATACAGAA GTTTCTTTTT AGTCTTTTAA ATGGTAATAA AGGGACAAAT 361 ACAATGATCA TGATTGCTTG CTTCAGAGTA ATCACTCTAA AATAGACAGC AATAATGTTC 421 TAAACCAAAC ACTGCTCTGC TTAACTCATT ATATTGGAGT TTTGATCTGT AATATGTTTC 481 T

10、ACTTTAACA ACAACAAAAA AAATTGAGGA GCATAATTAG AAATGCTTGT TCAAGAAACA 541 AAGAAGTAAA GCAAAGAAAA AGGAAGGAAA AAACATTGCT GGAGCAAAAT ATGATGGGAG 601 ACGATGGATA GAAAAATTAT TTTTGGTTTG GTCAGCATAT ATAAATGATT ATAATTCTTT 661 GGTTTTTCAG TTTCTCACAG TCCTTAATTG TTTGTTTCCC AGCCCAGGAT GAAGTCCATC 721 CAGTTCTGCT T圖2 波爾山羊FS

11、H基因部分序列3 討論由于沒有山羊FSH基因全序列的報(bào)道，因此在本實(shí)驗(yàn)中PCR引物的設(shè)計(jì)主要參照牛和綿羊等物種的FSH基因序列，所用引物的擴(kuò)增效果非常穩(wěn)定，說明利用近緣物種的DNA序列設(shè)計(jì)，對不同物種的同源DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增是可行的。由于本實(shí)驗(yàn)測定出的FSH基因序列731 bp主要由第1內(nèi)含子構(gòu)成（641bp），因此造成整個(gè)測定出的序列與內(nèi)含子1的各堿基含量相近并表現(xiàn)出相同的特點(diǎn)：A+T的含量顯著高于G+C，這與一些文獻(xiàn)中認(rèn)為非編碼區(qū)中A+T含量高的結(jié)果一致6。另外，從GenBank中獲得的幾個(gè)物種FSH基因全序列中G+C含量分別為牛（M83753）37.91%，水牛(AY449463)37.

12、03%,綿羊(S64745)38.72%，豬(D00621)38.44%，小鼠（U12932）41.85%，朱鷺(AB089502)37.97%。這些表明已知的動物FSH基因序列G+C含量在總是小于A+T的含量，表明FSH基因在動物基因組中處于貧GC區(qū)域7。雖然在所測定出的兩條序列中，沒有檢出堿基突變或插入/缺失，但根據(jù)FSH基因在動物繁殖中的重要作用以及它在豬的產(chǎn)仔性狀方面的研究成果8, 9，在今后研究中，可以進(jìn)一步探索該基因片段甚至整個(gè)FSH基因與波爾山羊高繁殖性能的密切聯(lián)系，以期找到有效的基因標(biāo)記應(yīng)用于山羊的繁殖性能研究中。 參考文獻(xiàn)(References): 1 Marshall JC

13、 & Kelch RP. GnRH: role of pulsatile secretion in the regulation of reproductionJ. New England Journal of Medicine ,1986,315:1 4591 468.2茍德明，李文鑫，黃健等。人絨毛膜促性腺激素、亞基cDNA的篩選與序列分析J.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，1999，15（6）：899902.3Layman L C., McDonough P G. Mutations of follicle stimulating hormone and its receptor in h

14、uman and mouse: genotype/phenotypeJ.Molecular and Cellular Endocrinology, 2000, 161( 12): 917.4陳圣偶 主編.養(yǎng)羊全書M.四川科學(xué)技術(shù)出版社,2000年第二版:445金冬雁,黎孟楓.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)M.北京:科學(xué)出版社,1996,464467.6張靜,楊自天,劉次全.內(nèi)含子序列的“三堿基組”的信息分析J.云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1997,19(3):324327.7Armstrong D. T. Recent advances in superovulation of cattleJ.Theriogenology, 1993, 39(1):7-24.8趙要風(fēng)，李寧,肖璐,曹更生，陳怡真，陳