生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果、操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。2、實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行，注意觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并把實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果及時(shí)如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，課后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析。3、實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好。4、注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護(hù)儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞。5、實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠(yuǎn)離火源。實(shí)驗(yàn)結(jié)束離開實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。6、若發(fā)生酸堿灼燒事故，應(yīng)用大量自來

2、水沖洗，酸灼傷者用飽和NaHCO3溶液中和，堿灼傷者用飽和H3BO3溶液中和，氧化劑傷害者用Na2S2O4處理。7、所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。2實(shí)驗(yàn)考試和考核方法實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)占總分的15，其中理論考試占5分，見理論考試試卷。每次實(shí)驗(yàn)為2.5分，其中： 1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告占1分（實(shí)驗(yàn)的報(bào)告占0.5分，分析討論0.5分。）。 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果占0.4分（結(jié)果的正確度），操作考核占0.4分：包括分光光度法測試，離心機(jī)使用，層析法，電泳法等基本操作。實(shí)驗(yàn)態(tài)度占0.7分。3實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 1、實(shí)驗(yàn)題目，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者姓名2、目的3、原理

3、（簡單明了）4、操作不寫5、結(jié)果，定性要分析，定量要列表6、結(jié)論：總結(jié)分析4試劑使用規(guī)則1、使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需。2、取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。3、取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。4、使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。5、使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。5使用過的玻璃儀器的清洗1、一般非計(jì)量玻璃儀器或粗容量儀器，如燒杯、試管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗

4、12次，倒置晾干。2、容量分析儀器，如滴定管、容量瓶等先用自來水沖洗，瀝干后，浸于鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)。然后用自來水反復(fù)沖洗干凈，干燥備用。3、用完比色杯后，立即用自來水反復(fù)沖洗。切忌用刷子、粗糙的布或紙擦拭。洗凈后，倒置晾干備用。6吸量管的種類和使用1、分類 1）奧氏吸量管 供準(zhǔn)確量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液體所用。這種吸量管只有一個(gè)刻度，當(dāng)放出所量取的液體時(shí)，管尖余留的液體必須吹入容器內(nèi)。 2）移液管 常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液體，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，管尖需在容器內(nèi)滯留15秒。注意管尖殘留的液體不要吹出

5、。 3）刻度吸量管 供量取10 ml以下任意體積的溶液。一般刻度包括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，吸量管上端標(biāo)有“吹”字。未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。2、使用原則 量取整數(shù)量液體，并且取量要求準(zhǔn)確時(shí)，應(yīng)該選用奧氏吸量管。量取大體積時(shí)要用移液管。同一定量實(shí)驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時(shí)，應(yīng)選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。7吸量管的使用1、正確拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端2、取液 用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。3、調(diào)刻度 吸量管與地面保持垂直

6、，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。4、放液 吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動(dòng)流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應(yīng)吹出尖端殘留的液體。移液管應(yīng)最后靠壁15秒。8一、分光光度法 原理光的本質(zhì)是一種電磁波，具有不同的波長，可見光的波長范圍在400760nm。波長范圍200400nm的光線稱為紫外光。有色物質(zhì)可以選擇性地吸收一部分可見光的光能量而呈現(xiàn)不同顏色，某些物質(zhì)卻能特征性地選擇吸收紫外光的能量。 9物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長的光可形成特定的吸收光譜。由于

7、物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定的條件下其吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比，所以可利用物質(zhì)的特定吸收光譜對其進(jìn)行定性和定量的分析。分光光度法就是利用各種物質(zhì)所具有的這種吸收特征所建立起來的分析方法。 10吸收光譜和物質(zhì)的定性分析 用各種不同波長的光線作為入射光測定物質(zhì)的吸光度（Absorbance），然后以波長（）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（A）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。在一定的溫度、pH值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（max）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長也

8、往往不同。11物質(zhì)用分光分析定性主要根據(jù)是吸收光譜存在的特征吸收。 常用定性方法： 1、比較吸收光譜曲線。2、比較最大吸收波長。3、比較吸光度比值。 12BeerLambert定律和物質(zhì)的定量分析 原理一束平行光照射至溶液時(shí)、一部分光被吸收、一部分光可透過該溶液、不同物質(zhì)光的吸收程度是不同的。物質(zhì)對單色光吸收的強(qiáng)弱以及溶液濃度與也曾厚度的關(guān)系，服從物質(zhì)對光吸收的定量定律，即BeerLambert定律，其表達(dá)式為： AKCL 或Lg I0/IKCL BeerLambert定律的含義為一束單色光通過溶液解質(zhì)后，光能被吸收的程度與溶液的濃度和厚度成正比。如果實(shí)驗(yàn)中的厚度不變，則AKC A為吸光度，T

9、為透光度，即I/I0，A和T是負(fù)對數(shù)的關(guān)系。 吸收系數(shù)K實(shí)際上式物質(zhì)在單位濃度和單位厚度下對入射光的吸光度，在一定波長下，K越大，表示物質(zhì)對光的吸收越強(qiáng)。13常用的以BeerLambert定律為依據(jù)的定量分析方法BeerLambert定律原理是討論有色溶液對單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法。配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按一定方法顯色后，分別用分光光度計(jì)測得吸光度。以吸光度為縱座標(biāo)、濃度為橫座標(biāo)，繪制AC曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測定被測溶液得吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定管的測定應(yīng)在同一儀器上進(jìn)行。142、標(biāo)準(zhǔn)管法。將標(biāo)

10、準(zhǔn)品（已知濃度Cs）與樣品在相同條件下顯色并測得吸光度。因?yàn)樵诖讼?，兩者的K值相等，所以可根據(jù) Cx(Cs/As) Ax 求得樣品溶液得濃度Cx。式中As和Ax分別為標(biāo)準(zhǔn)管測定 管的吸光度。3、克分子吸光系數(shù)法。當(dāng)濃度為IM，溶液厚度為1cm，吸光系數(shù)用表示，亦稱為克分子吸光系數(shù)。在已知得情況下，可根據(jù)下式求出測定液的物質(zhì)濃度 CA/15分光光度計(jì) 原理：分光光度計(jì)形式較多，但基本結(jié)構(gòu)和原理相似，可用下圖表示：儀器中光源經(jīng)過單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測量儀上顯示出吸光度（A）或透光度（T）儀器的光電管

11、或光電池對不同波長的光敏感度不一樣，在制作吸收曲線時(shí)應(yīng)注意每換一次波長，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)整到0。 光源單色器受光器測量器樣品室16分光光度計(jì)的類型1、單波長單光束分光光度計(jì)2、單波長雙光束分光光度計(jì)3、雙波長分光光度計(jì)最簡單常見的光度計(jì)是單波長單光束分光光度計(jì)，如751、721等。17使用方法 （以721為例） 該機(jī)的光譜范圍在360nm-800nm。 1、接通電源，打開機(jī)器開關(guān)，使儀器通電，打開箱蓋，預(yù)熱10分鐘。2、將空白液或?qū)φ找杭皽y定液分別裝入比色杯3/4體積并用軟紙擦清外壁，放入樣品室。3、調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀書盤上指針的吸光度為或透光率為0。調(diào)節(jié)測定所用波長。4、蓋

12、上箱蓋，光徑開關(guān)自動(dòng)打開。轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器使空白或?qū)φ展艿奈舛葹?，或透光率為100，待讀數(shù)指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干，通過讀數(shù)指針，讀取測定管上的吸光度。有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開關(guān)，才能正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度為。 5、讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈。 6、溶液定量測定時(shí)，應(yīng)注意吸光度在0.11.0范圍，濃度太大時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋。 *注意事項(xiàng)：1）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液體的體積裝滿比色杯的3/4。 3）不要將比色杯放在分光光度計(jì)上。18可見光紫外光光度計(jì) 該種機(jī)采用兩個(gè)光源，可在可見和紫外區(qū)對物質(zhì)進(jìn)行分析，鎢絲燈發(fā)出光的適宜范圍在3601000nm，氫燈發(fā)出光的適宜范圍在150400nm。 通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內(nèi)使用。19