基因操作原理04課件

1、第四章 大分子的分離和分析一、E.coli質(zhì)粒DNA的分離和純化1質(zhì)粒DNA的小量提取第一節(jié) DNA的分離、檢測和純化1質(zhì)粒DNA的小量提取 步驟性原理 在堿性條件下，線狀DNA變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀，高鹽條件下復(fù)性，除質(zhì)粒DNA外，形成沉淀。 步驟 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長、時(shí)間、量 細(xì)菌的收獲和裂解 質(zhì)粒DNA的純化（苯酚/氯仿 梯度離心）Sol I Tris-HCl, EDTA, Glucose Sol II NaOH-SDSSol III 3M KAc DNA purification Kit (QiaGen)二、DNA的電泳檢測主要檢測：分子量，含量及有無1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖 從海藻

2、中提取的一種線狀高聚物常規(guī)熔點(diǎn)低熔點(diǎn) Gelling point 25 20-30 Melting point 65 電壓 遷移率與電壓成正比 2kb 應(yīng) 5 U/cm 電場方向 單一方向 負(fù) 正 脈沖電場 幾百kb以上 溫度 4-30， 0.5% or 低熔點(diǎn) 4 buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.58.0) 堿性agarose電泳 用于分析 ssDNA/Southern 雜交 londing buff 溴酚藍(lán)/二甲苯菁FF 40% Sucrose 染色/攝影 EBt 0.5g/ml 10mg/ml store (棕色瓶or鉛鉑紙) UV 波長：長366nm, 短25

3、4, 一般3022. 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）優(yōu)點(diǎn): 分離率高 1 bp, 點(diǎn)樣量高 10g 回收的DNA純度高非變性: 遷移率與序列和組成有關(guān)變性(尿素/甲醛): 無關(guān)，分離探針，S1酸產(chǎn)物分析，DNA測序三、DNA片段的純化（從agarose）1.低熔點(diǎn)agarose電泳 gel + 5vol tris 65 5min phenol extract ethanol2.透析袋，電洗脫法 可用于5kb3.Glass Milk (bead) 3M NaI 溶液，bead吸附 洗滌 elute4.Kit Qiagen 公司一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含 10-5g RNA，其中80-85%為rRN

4、A(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三種類型)，其余1520%主要由各種類型的低分子量RNA組成（如tRNA，核內(nèi)小分子RNA等）。mRNA為總RNA的15%，3端有一個(gè)poly(A)尾，可與oligo(dT)-纖維素，吸附，親和層析分離寡脫氧胸苷酸。第二節(jié) RNA的分離、純化和檢測一、注意事項(xiàng)控制RNA酶的活性(一) 實(shí)驗(yàn)用具和溶液的去RNA酶處理1. 玻璃制品、塑料制品、電泳槽一次性使用用品/第一次使用的用具，可稍作處理器皿：180 8hr or longer， 氯仿沖洗/NaOH/專用溶液 0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)、浸泡(37，2hr) (RNA酶的強(qiáng)列抑制劑，但不

5、絕對) 無菌水(or DEPC水)洗滌 100烤15min濕熱滅菌電泳槽: 洗凈,水沖洗, 乙醇干燥 3%H2O2 10min 0.1% DEPC H2O 水洗2H2O：0.1% DEPC 溶液：用DEPC水配制 （注意有些藥品，不能用DEPC,如Tris）3其它 如手套，保持干凈、清潔（二）RNA酶抑制劑1蛋白質(zhì)抑制劑 人胎盤RNase抑制劑2氧銅核糖核苷復(fù)合物 100%抑制（且抑制體外翻譯）3硅藻土，吸附RNase二、RNA的抽提1文獻(xiàn)法2Kit Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD 酚+異硫氰酸胍 Qiagen/RNAeasy三、純化1蛋白質(zhì)的去除（見上）

6、2DNA的去除 DNase I （RNase free） inhibitor3Kit4梯度離心四、mRNA的純化1親和層析2純度檢測 OD260: 1=40g/ml RNA五、電泳1瓊脂糖凝膠 氫氧化甲基汞 甲醛 乙二醛-二甲基亞礬（DMSO）2PAGE1檢測蛋白質(zhì)分子量2Western blot3N-torminal amino acid sequence第三節(jié) 蛋白質(zhì)的SDS第四節(jié) 分子雜交 molecular hybridization1. 根據(jù)被雜交的對象分為Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature變性：熱，極端pH，

7、有機(jī)溶劑，尿素 annealing復(fù)性： 互補(bǔ)單鏈重新配對恢復(fù)成雙鏈為復(fù)性 hybridization雜交： 同源單鏈重新配對恢復(fù)成雙鏈為雜性一、Southern blot(一)DNA片段的轉(zhuǎn)移1酶切2電泳/照相中性堿性（0.4N, NaOH）3. 變性/中和 大片段 脫嘌呤 0.2N, HCl 10min 0.5N NaOH/1.5M NaCl 1M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl4. 轉(zhuǎn)移 Nitrocellulose membrane NC nylon membrane (charged or not) 6SSC (or SSPE)轉(zhuǎn)移 buffer 毛細(xì)管 電轉(zhuǎn)移 真空濾紙

8、凝膠濾膜吸水紙玻璃板重物支持物500g時(shí)間: 1kb 15kb 18hr5固定 80 2hr, UV, microwave(二) 雜交 hybridization1. 預(yù)雜交prehybridization6SSCDenhardt(50 x)：(含F(xiàn)icoll,聚乙烯比咯烷酮)變性魚精DNA0.5% SDS其他預(yù)雜交液: 脫脂牛奶 ExpressHyb (Clontech公司) (1-2 Hr) 2. 雜交 探針處理 溫度 42 50%甲酰胺 時(shí)間 6-8小時(shí) 探針：DNA, Oligo, 隨機(jī)DNA3. 洗膜 2SSC/0.5% SDS 15min RT 0.1SSC/0.5 % SDS 1

9、hr at 雜交溫度（三）檢測 X-film or 生化 Phosphor image（四）探針的標(biāo)記 probe labeling1均一標(biāo)記 切口平移nick traslation: E.coli DNA polyI 隨機(jī)引物 random primer: 6Nt or 612nt klenow 2單鏈探針 ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探針 RNA探針，RNA polymerase3末端標(biāo)記 Klenow 標(biāo)記3端, 補(bǔ)平和置換反應(yīng) T4 polymerase 標(biāo)記3端 3-5外物活性強(qiáng)，特別適用于3突出末端 Kinase 標(biāo)記5端 正反應(yīng) 32P5-OH NNNN5pNNNN

10、交換反應(yīng) 過量ATP 使5-PADP then 32P5 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記34寡核苷酸 Kinase 末端轉(zhuǎn)移酶5標(biāo)記物 放射性: 32P，33P，35S 非放射性: DIGoxigenin Biotin 標(biāo)記 dUTP(五) DIG標(biāo)記/檢測舉例1.探針標(biāo)記6 Nt隨機(jī)寡核序列苷酸引物, Klenow標(biāo)記2檢測 漂洗 blocking 免疫反應(yīng) labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗滌 顯色反應(yīng) 化學(xué)發(fā)光檢測 NBT-BCIP 形成棕黃色沉淀BCIP：5-溴-4-氯-3吲哚磷酸NBT: 氯化硝基四氮唑藍(lán)（染料色素） CIP的底物, 也稱氮藍(lán)四唑優(yōu)點(diǎn)：無污染，方便，探針可重復(fù)使用，可控

11、制顯色反應(yīng)，保存雜交膜，易辯別真假陽性缺點(diǎn)：靈敏度不夠，不能多次雜交， 只有0.1pg可檢測單拷貝，如g人胎盤DNA中的單拷貝二、原位雜交 菌落雜交和空斑雜交1. 菌落生長 點(diǎn)種: 將陽性重組子二個(gè)平板上(有/無膜) 加CK 影印: 菌落和空斑，絕大多數(shù)應(yīng)為重組子(白色菌落)2DNA的釋放與固定 有多種方法 10%SDS； 0.5N NaOH/1.5N NaCl 0.5M Tris 1.5N NaCl SSC 干燥 固定 80 2hr三、斑點(diǎn)雜交類似上述方法，直接將DNA樣品點(diǎn)在雜交膜上。四、Northern blot 類似于Southern blot但用于檢測RNA的分子雜交技術(shù),用于分析總

12、RNA或 mRNA。1電泳緩沖液 甲醛buf (5) 0.1mM MOPS(pH2.0) (3-(N-瑪琳代)丙磺酸) 40mM NaAc 5mM EDTA(pH8.0) DEPC H2O 制膠 甲醇（MW 30.03）通常為37%水溶液，12.3M（pH4.0） 終濃度，1buf + 2.2M甲醇2上樣 預(yù)處理 RNA（up to 30g）4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5l 甲酰胺 10l 65 15min loading buf 50% 甘油，1mM EDTA(pH8.0) 0.25% BPB 0.255二甲苯TFF3電泳 loading 之前，預(yù)電泳5min 5V/cm 電泳1

13、2hr后，混合正負(fù)極電泳液4轉(zhuǎn)膜預(yù)處理 DEPC H2O洗滌去除甲醛 if agarose10% or 厚度0.5cm or 2.5kb 需用0.05M NaOH 處理20min,部分水解RNA 無RNase H2O洗滌, 20SSC 浸泡45min 轉(zhuǎn)移, 同Southern五、Western blot基本原理同其它 blot方式, 檢測蛋白質(zhì)與Southern的關(guān)鍵區(qū)別在于探針性質(zhì): 抗體(一) 抗體的要求1單克隆抗體 但并非都適合，由于靶蛋白已變性。2多克隆抗體抗體為混合物，對其特異性,親和力及濃度都一無所知對由SDS/還原劑變性處理的目標(biāo)蛋白是否還能識別應(yīng)做預(yù)備實(shí)驗(yàn)(二) 簡要步驟1樣品制備 SDS樣品2running SDS3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 硝酸纖維素濾膜，電轉(zhuǎn)移:三夾板/隔離電極板 干燥4染色 麗春紅S or 印度墨水（射啟性檢測適用） 但現(xiàn)少采用，由于有prestain MW marker5封閉背景 脫脂奶粉 5%6第一抗體與靶蛋白結(jié)合7二級免疫反應(yīng) 抗免疫球蛋白抗體 或 A蛋白A蛋白可與IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割I(lǐng)gG Fragment antigen binding, Fragment crystalline 標(biāo)記：125I 堿性磷酸酶 辣根過氧化物酶 偶聯(lián)8檢測辣根（HRP