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文檔簡(jiǎn)介
1、第四章 大分子的分離和分析一、E.coli質(zhì)粒DNA的分離和純化1質(zhì)粒DNA的小量提取第一節(jié) DNA的分離、檢測(cè)和純化1質(zhì)粒DNA的小量提取 步驟性原理 在堿性條件下,線狀DNA變性,質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀,高鹽條件下復(fù)性,除質(zhì)粒DNA外,形成沉淀。 步驟 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、時(shí)間、量 細(xì)菌的收獲和裂解 質(zhì)粒DNA的純化(苯酚/氯仿 梯度離心)Sol I Tris-HCl, EDTA, Glucose Sol II NaOH-SDSSol III 3M KAc DNA purification Kit (QiaGen)二、DNA的電泳檢測(cè)主要檢測(cè):分子量,含量及有無(wú)1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖 從海藻
2、中提取的一種線狀高聚物常規(guī)熔點(diǎn)低熔點(diǎn) Gelling point 25 20-30 Melting point 65 電壓 遷移率與電壓成正比 2kb 應(yīng) 5 U/cm 電場(chǎng)方向 單一方向 負(fù) 正 脈沖電場(chǎng) 幾百kb以上 溫度 4-30, 0.5% or 低熔點(diǎn) 4 buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.58.0) 堿性agarose電泳 用于分析 ssDNA/Southern 雜交 londing buff 溴酚藍(lán)/二甲苯菁FF 40% Sucrose 染色/攝影 EBt 0.5g/ml 10mg/ml store (棕色瓶or鉛鉑紙) UV 波長(zhǎng):長(zhǎng)366nm, 短25
3、4, 一般3022. 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)優(yōu)點(diǎn): 分離率高 1 bp, 點(diǎn)樣量高 10g 回收的DNA純度高非變性: 遷移率與序列和組成有關(guān)變性(尿素/甲醛): 無(wú)關(guān),分離探針,S1酸產(chǎn)物分析,DNA測(cè)序三、DNA片段的純化(從agarose)1.低熔點(diǎn)agarose電泳 gel + 5vol tris 65 5min phenol extract ethanol2.透析袋,電洗脫法 可用于5kb3.Glass Milk (bead) 3M NaI 溶液,bead吸附 洗滌 elute4.Kit Qiagen 公司一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含 10-5g RNA,其中80-85%為rRN
4、A(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三種類型),其余1520%主要由各種類型的低分子量RNA組成(如tRNA,核內(nèi)小分子RNA等)。mRNA為總RNA的15%,3端有一個(gè)poly(A)尾,可與oligo(dT)-纖維素,吸附,親和層析分離寡脫氧胸苷酸。第二節(jié) RNA的分離、純化和檢測(cè)一、注意事項(xiàng)控制RNA酶的活性(一) 實(shí)驗(yàn)用具和溶液的去RNA酶處理1. 玻璃制品、塑料制品、電泳槽一次性使用用品/第一次使用的用具,可稍作處理器皿:180 8hr or longer, 氯仿沖洗/NaOH/專用溶液 0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)、浸泡(37,2hr) (RNA酶的強(qiáng)列抑制劑,但不
5、絕對(duì)) 無(wú)菌水(or DEPC水)洗滌 100烤15min濕熱滅菌電泳槽: 洗凈,水沖洗, 乙醇干燥 3%H2O2 10min 0.1% DEPC H2O 水洗2H2O:0.1% DEPC 溶液:用DEPC水配制 (注意有些藥品,不能用DEPC,如Tris)3其它 如手套,保持干凈、清潔(二)RNA酶抑制劑1蛋白質(zhì)抑制劑 人胎盤RNase抑制劑2氧銅核糖核苷復(fù)合物 100%抑制(且抑制體外翻譯)3硅藻土,吸附RNase二、RNA的抽提1文獻(xiàn)法2Kit Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD 酚+異硫氰酸胍 Qiagen/RNAeasy三、純化1蛋白質(zhì)的去除(見(jiàn)上)
6、2DNA的去除 DNase I (RNase free) inhibitor3Kit4梯度離心四、mRNA的純化1親和層析2純度檢測(cè) OD260: 1=40g/ml RNA五、電泳1瓊脂糖凝膠 氫氧化甲基汞 甲醛 乙二醛-二甲基亞礬(DMSO)2PAGE1檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量2Western blot3N-torminal amino acid sequence第三節(jié) 蛋白質(zhì)的SDS第四節(jié) 分子雜交 molecular hybridization1. 根據(jù)被雜交的對(duì)象分為Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature變性:熱,極端pH,
7、有機(jī)溶劑,尿素 annealing復(fù)性: 互補(bǔ)單鏈重新配對(duì)恢復(fù)成雙鏈為復(fù)性 hybridization雜交: 同源單鏈重新配對(duì)恢復(fù)成雙鏈為雜性一、Southern blot(一)DNA片段的轉(zhuǎn)移1酶切2電泳/照相中性堿性(0.4N, NaOH)3. 變性/中和 大片段 脫嘌呤 0.2N, HCl 10min 0.5N NaOH/1.5M NaCl 1M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl4. 轉(zhuǎn)移 Nitrocellulose membrane NC nylon membrane (charged or not) 6SSC (or SSPE)轉(zhuǎn)移 buffer 毛細(xì)管 電轉(zhuǎn)移 真空濾紙
8、凝膠濾膜吸水紙玻璃板重物支持物500g時(shí)間: 1kb 15kb 18hr5固定 80 2hr, UV, microwave(二) 雜交 hybridization1. 預(yù)雜交prehybridization6SSCDenhardt(50 x):(含F(xiàn)icoll,聚乙烯比咯烷酮)變性魚(yú)精DNA0.5% SDS其他預(yù)雜交液: 脫脂牛奶 ExpressHyb (Clontech公司) (1-2 Hr) 2. 雜交 探針處理 溫度 42 50%甲酰胺 時(shí)間 6-8小時(shí) 探針:DNA, Oligo, 隨機(jī)DNA3. 洗膜 2SSC/0.5% SDS 15min RT 0.1SSC/0.5 % SDS 1
9、hr at 雜交溫度(三)檢測(cè) X-film or 生化 Phosphor image(四)探針的標(biāo)記 probe labeling1均一標(biāo)記 切口平移nick traslation: E.coli DNA polyI 隨機(jī)引物 random primer: 6Nt or 612nt klenow 2單鏈探針 ssDNA模板,通用引物,合成ssDNA探針 RNA探針,RNA polymerase3末端標(biāo)記 Klenow 標(biāo)記3端, 補(bǔ)平和置換反應(yīng) T4 polymerase 標(biāo)記3端 3-5外物活性強(qiáng),特別適用于3突出末端 Kinase 標(biāo)記5端 正反應(yīng) 32P5-OH NNNN5pNNNN
10、交換反應(yīng) 過(guò)量ATP 使5-PADP then 32P5 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記34寡核苷酸 Kinase 末端轉(zhuǎn)移酶5標(biāo)記物 放射性: 32P,33P,35S 非放射性: DIGoxigenin Biotin 標(biāo)記 dUTP(五) DIG標(biāo)記/檢測(cè)舉例1.探針標(biāo)記6 Nt隨機(jī)寡核序列苷酸引物, Klenow標(biāo)記2檢測(cè) 漂洗 blocking 免疫反應(yīng) labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗滌 顯色反應(yīng) 化學(xué)發(fā)光檢測(cè) NBT-BCIP 形成棕黃色沉淀BCIP:5-溴-4-氯-3吲哚磷酸NBT: 氯化硝基四氮唑藍(lán)(染料色素) CIP的底物, 也稱氮藍(lán)四唑優(yōu)點(diǎn):無(wú)污染,方便,探針可重復(fù)使用,可控
11、制顯色反應(yīng),保存雜交膜,易辯別真假陽(yáng)性缺點(diǎn):靈敏度不夠,不能多次雜交, 只有0.1pg可檢測(cè)單拷貝,如g人胎盤DNA中的單拷貝二、原位雜交 菌落雜交和空斑雜交1. 菌落生長(zhǎng) 點(diǎn)種: 將陽(yáng)性重組子二個(gè)平板上(有/無(wú)膜) 加CK 影印: 菌落和空斑,絕大多數(shù)應(yīng)為重組子(白色菌落)2DNA的釋放與固定 有多種方法 10%SDS; 0.5N NaOH/1.5N NaCl 0.5M Tris 1.5N NaCl SSC 干燥 固定 80 2hr三、斑點(diǎn)雜交類似上述方法,直接將DNA樣品點(diǎn)在雜交膜上。四、Northern blot 類似于Southern blot但用于檢測(cè)RNA的分子雜交技術(shù),用于分析總
12、RNA或 mRNA。1電泳緩沖液 甲醛buf (5) 0.1mM MOPS(pH2.0) (3-(N-瑪琳代)丙磺酸) 40mM NaAc 5mM EDTA(pH8.0) DEPC H2O 制膠 甲醇(MW 30.03)通常為37%水溶液,12.3M(pH4.0) 終濃度,1buf + 2.2M甲醇2上樣 預(yù)處理 RNA(up to 30g)4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5l 甲酰胺 10l 65 15min loading buf 50% 甘油,1mM EDTA(pH8.0) 0.25% BPB 0.255二甲苯TFF3電泳 loading 之前,預(yù)電泳5min 5V/cm 電泳1
13、2hr后,混合正負(fù)極電泳液4轉(zhuǎn)膜預(yù)處理 DEPC H2O洗滌去除甲醛 if agarose10% or 厚度0.5cm or 2.5kb 需用0.05M NaOH 處理20min,部分水解RNA 無(wú)RNase H2O洗滌, 20SSC 浸泡45min 轉(zhuǎn)移, 同Southern五、Western blot基本原理同其它 blot方式, 檢測(cè)蛋白質(zhì)與Southern的關(guān)鍵區(qū)別在于探針性質(zhì): 抗體(一) 抗體的要求1單克隆抗體 但并非都適合,由于靶蛋白已變性。2多克隆抗體抗體為混合物,對(duì)其特異性,親和力及濃度都一無(wú)所知對(duì)由SDS/還原劑變性處理的目標(biāo)蛋白是否還能識(shí)別應(yīng)做預(yù)備實(shí)驗(yàn)(二) 簡(jiǎn)要步驟1樣品制備 SDS樣品2running SDS3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 硝酸纖維素濾膜,電轉(zhuǎn)移:三夾板/隔離電極板 干燥4染色 麗春紅S or 印度墨水(射啟性檢測(cè)適用) 但現(xiàn)少采用,由于有prestain MW marker5封閉背景 脫脂奶粉 5%6第一抗體與靶蛋白結(jié)合7二級(jí)免疫反應(yīng) 抗免疫球蛋白抗體 或 A蛋白A蛋白可與IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割I(lǐng)gG Fragment antigen binding, Fragment crystalline 標(biāo)記:125I 堿性磷酸酶 辣根過(guò)氧化物酶 偶聯(lián)8檢測(cè)辣根(HRP
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