基因工程的基本操作程序課件

1、1.2基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過(guò)程目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成請(qǐng)閱讀P8、9第一和二兩段一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中直接獲取1.基因文庫(kù)：概念見(jiàn)P92.基因文庫(kù)的分類(lèi):按外源DNA片段的來(lái)源分類(lèi)種類(lèi)基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫(kù)3.基因文庫(kù)的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便

2、于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見(jiàn)課本P9（一）基因文庫(kù)的構(gòu)建（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許 多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)1、 概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù) 通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因 因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、原理：DNA復(fù)制

3、二、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸(dNTP) 一對(duì)引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA( 需含有目的基因 ) 4、條件：一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物3、前提：溫度控制IMN變性復(fù)性延伸5/3/GGTC3/5/GACC5/3/引物GG變性復(fù)性延伸1、變性(90-95度)：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性（55-60）：引物與兩條單鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；3.延伸（70-75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，從5端3端進(jìn)行延伸。5/3/AG引物5、擴(kuò)增過(guò)程利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)

4、擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成_ b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物的_延伸，合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5端3端（三）通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)合成 當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。DNA合成儀質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA1.用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出_。2

5、.用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。 科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗

6、蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。 資 料:基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因知識(shí)點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾

7、端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子： 外顯子： 知識(shí)點(diǎn)一：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等