免疫學(xué)技術(shù)復(fù)習(xí)思考題及答案

1、復(fù)習(xí)思考題：免疫細(xì)胞分離的基本原理（密度、黏附吞噬、表面標(biāo)志、生長(zhǎng)因子）應(yīng)用 于哪些細(xì)胞？細(xì)胞因子檢測(cè)的三大基本方法（原理、優(yōu)缺點(diǎn)）FACS法測(cè)CD分子的基本原理MACS法分離細(xì)胞的原理ELISA和ELISPOT實(shí)驗(yàn)原理T細(xì)胞增殖試驗(yàn)的基本原理、基本方法細(xì)胞凋亡的測(cè)定原理和方法概括免疫學(xué)技術(shù)主要內(nèi)容單克隆抗體制備的原理和基本過(guò)程凝集、沉淀反應(yīng)的主要方法（名稱(chēng)和基本原理）各種免疫標(biāo)記技術(shù)的標(biāo)記物及示蹤原理免疫熒光技術(shù)的各種實(shí)驗(yàn)策略ELISA的基本原理和各種實(shí)驗(yàn)策略Western blot的基本原理1.ELISA技術(shù)原理和實(shí)驗(yàn)策略ELISA全名為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。原理是將抗原或抗體包被在固相載表面

2、，并保 留其免疫活性，然后再與酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）聯(lián)結(jié)，并保留酶活性。洗去游 離的酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原），然后加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化變成有色 產(chǎn)物。反映顏色深淺與相應(yīng)的抗原或抗體的量相關(guān)，據(jù)此進(jìn)行定性和定量分析。 主要的實(shí)驗(yàn)策略有：雙抗體夾心法：此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。將待分析物的特異性 抗體與固相載體連接形成固相抗體，經(jīng)封閉和洗滌后加受檢標(biāo)本（抗原）形成固 相抗體一抗原復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)抗體生成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體的復(fù) 合物，洗滌和底物顯色。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定 雙位點(diǎn)一步法：在雙抗夾心基礎(chǔ)上，改為應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同決定簇的

3、兩種單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。其優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定時(shí)標(biāo)本可與酶標(biāo)抗 體同時(shí)加入進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，兩種抗體互不干擾。省時(shí)簡(jiǎn)便。但是當(dāng)待測(cè)抗原濃度 過(guò)高時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。間接法：檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相 結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。用已知抗原包被固相載體，加待檢標(biāo)本與固相 抗原結(jié)合，洗滌后加酶標(biāo)抗抗體與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，經(jīng)洗滌，底 物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗體的定性或定量測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)法：此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。用已知特異 性抗體包被固相載體。測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，對(duì)照管只

4、加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合。經(jīng)洗滌，底物顯色， 分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測(cè) 抗原含量。對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深； 測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如 待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗 原量減少。加入底物后顯色反應(yīng)較弱，兩者呈負(fù)相關(guān)。ABS-ELISA法：ABS即親和素-生物素系統(tǒng)，每個(gè)親和素分子能結(jié)合4個(gè)生物素。通 過(guò)親和素-生物素系統(tǒng)與酶偶聯(lián)能產(chǎn)生更大的放大效應(yīng)以提高靈敏度。ELISPOT技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)ELISPOT全名為酶聯(lián)免

5、疫斑點(diǎn)檢測(cè)，結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與ELISA技術(shù)，能夠 在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理簡(jiǎn)單講就是：用抗體捕獲培 養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)。細(xì)胞受到 刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被 捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，然后用酶標(biāo)親和素再與生物素結(jié)合， 進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通 過(guò)ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝 酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲

6、細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。 在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時(shí)之內(nèi)，T細(xì)胞就會(huì) 開(kāi)始分泌各種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子當(dāng)即就被位于細(xì)胞下方的膜上的單克隆抗體所 捕獲。在洗去細(xì)胞之后，被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合， 然后用酶標(biāo)親和素再與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成 一個(gè)個(gè)圓形的斑點(diǎn)。Western blot的基本原理通過(guò)電泳區(qū)分不同的組分并轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能 保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的 抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯

7、影以檢 測(cè)電泳分離的蛋白成分。Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特 異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至15ng （最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？答：一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而用于ELISA的抗體則要 看抗原種類(lèi)，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō) 明書(shū)來(lái)確定。免疫熒光技術(shù)的示蹤原理和各種實(shí)驗(yàn)策略（IF）原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光 標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或

8、組織內(nèi)的相應(yīng)抗 原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光 顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見(jiàn)熒光所在 的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 直接法：熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。間接法：特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。 補(bǔ)體結(jié)合法：通過(guò)補(bǔ)體反應(yīng)形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物，然后熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體 特異性抗體在與補(bǔ)體反應(yīng)發(fā)出熒光。雙結(jié)合法：兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒 光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。簡(jiǎn)述IF、western blot、EL

9、ISA的在應(yīng)用中的區(qū)別。免疫熒光是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)熒光激發(fā)， 來(lái)對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。樣本是細(xì) 胞或組織，要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽(yáng)性、質(zhì)陽(yáng)性和核陽(yáng)性。ELISA （酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿液、細(xì)胞或 組織培養(yǎng)上清液，因而沒(méi)有用到組織包埋、切片等技術(shù)，這是與免疫組化的主要 區(qū)別，操作上開(kāi)始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來(lái)形成的 抗原-抗體-酶-底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。WB先要進(jìn)行SDS，然后將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)

10、儀轉(zhuǎn)移到固相載體上， 而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來(lái)檢測(cè)樣品，可以用于定性和半定量。WB可以看到特異性的條帶，但是定量比較麻煩；只能半定量，但是可以檢測(cè) 細(xì)胞膜蛋白，這點(diǎn)ELISA做不到；所檢測(cè)的一般是抗原，而ELISA抗原抗體都 可以檢測(cè)；所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物 等，WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的；而ELISA無(wú)能為力；一次 處理量就是一塊膠版，10-20個(gè)樣品最多了。ELISA 一塊96孔板一次可以處理 96個(gè)樣本，可以設(shè)置多個(gè)復(fù)孔、對(duì)照、梯度樣等來(lái)提高檢測(cè)的可信度；ELISA 可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不

11、可信。各種免疫標(biāo)記技術(shù)的標(biāo)記物及示蹤原理凝集、沉淀反應(yīng)的主要方法（名稱(chēng)和基本原理）沉淀反應(yīng)的定義：是指可溶性抗原分子與特異性抗體分子在溶液或凝膠中相混合 形成復(fù)合物，當(dāng)兩者的比例合適時(shí)，可相互作用產(chǎn)生較大的不溶性免疫復(fù)合物析 出，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的不溶性沉淀物。根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的環(huán)境條件及附加因素，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式：溶液中沉淀反應(yīng)：是指在清徹透明的液體中，呈溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試 管內(nèi)或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見(jiàn)的絮狀或顆粒狀的不溶性沉淀物。常 用的有：環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，免疫比濁法，免疫沉淀技術(shù)凝膠中沉淀反應(yīng)：即將抗原抗體溶液放在瓊脂凝膠板上的小孔中，使它們彼 此對(duì)向擴(kuò)散，在抗原抗

12、體相遇的地方形成沉淀線。此沉淀線的突出性質(zhì)是：特異 性抗原抗體不能通過(guò)；與沉淀線無(wú)關(guān)的抗原和抗體分子則可自由通過(guò)此沉淀線。 主要包括：?jiǎn)蜗嗝庖邤U(kuò)散試驗(yàn)：將混有抗體的瓊脂糖溶液制成平板，在平板上打孔，加入標(biāo) 本，如標(biāo)本中有相應(yīng)抗原，會(huì)向四周擴(kuò)散，在濃度比例合適的地方形成沉淀環(huán)。 沉淀環(huán)的直徑或面積的大小與抗原量有關(guān)。雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)：將抗原與其相應(yīng)抗體放在凝膠（如瓊脂）平板的鄰近孔內(nèi)， 使們互相擴(kuò)散，當(dāng)擴(kuò)散到兩者濃度比例合適的部位相遇時(shí)，即出現(xiàn)沉淀線。結(jié)果分析：Q抗原或抗體的純度；若在兩孔內(nèi)有兩對(duì)或兩對(duì)以上的抗原抗體系統(tǒng)，就能產(chǎn)生 相應(yīng)數(shù)量的分離的沉淀線。Q抗原或抗體相對(duì)濃度：抗原濃度越高，形成

13、的沉淀線距離抗原 孔越遠(yuǎn)，抗體濃度越高，形成的沉淀線距抗體孔越遠(yuǎn)；Q抗原或抗體相對(duì)分子量：抗原或抗 體在瓊脂內(nèi)的擴(kuò)散受分子量影響，分子量大者擴(kuò)散速度慢，擴(kuò)散圈小，局部濃度高，因此形 成的沉淀圈彎向分子量大的一方，若二者分子量相等，則沉淀線呈直線；Q抗原性質(zhì)：觀察 兩個(gè)鄰近孔的抗原與抗體所形成的兩條線是交叉抑或相連，可用來(lái)判斷該兩抗原是否有共同 成分。同樣的純抗原a放在兩個(gè)鄰近的孔中，對(duì)應(yīng)抗體放在中央孔中，兩條沉淀線在其相鄰 的末端會(huì)互相連接和融合；若兩個(gè)不同的抗原a和b，則兩線互相交叉；若兩個(gè)抗原有部分 相同成分a和ab，則兩線除有相連部分以外還有一伸出部分。滴定抗體效價(jià)：固定抗原 濃度，稀釋

14、抗體，出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋度為該抗體的效價(jià)。免疫電泳：免疫電泳是區(qū)帶電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原先進(jìn)行 電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開(kāi)。停止電泳后與電泳方 向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗血清，再做雙相免疫擴(kuò)散，已分離的各抗原成分 與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，各區(qū)帶在相應(yīng)位置與Ab形成沉淀弧。對(duì)流免疫電泳：在pH8.6的溶液中，大部分蛋白抗原帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移 動(dòng)；IgG分子量大，帶的電荷少，在電場(chǎng)中雖也向正極移動(dòng)，但速度緩慢。由于 電滲引起負(fù)極移動(dòng)的潮流速度超過(guò)了 IgG向正極的移動(dòng)，帶動(dòng)抗體移向負(fù)極，形 成與抗原間的對(duì)流。二者相遇后，在最適比例處形成沉淀線。

15、火箭電泳試驗(yàn)：電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場(chǎng)的作用下 促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形 狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與樣本中的抗原濃度呈正相關(guān)。 凝集反應(yīng)的定義：是指顆粒型抗原(如細(xì)菌，紅細(xì)胞或吸附在紅細(xì)胞上的抗原等) 與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，可形成肉眼可見(jiàn)的凝 集團(tuán)塊。1 .直接凝集反應(yīng)：是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與其相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì) 胞凝集現(xiàn)象。(肥達(dá)氏反應(yīng)，血型鑒定等)間接凝集反應(yīng)：用可溶性抗原(或抗體)包被在一種與免疫無(wú)關(guān)的、具一定 大小的不溶性顆粒(即載體顆粒)的表面，然后與相應(yīng)抗

16、體(或抗原)作用，在 有適宜電解質(zhì)存在的條件下，結(jié)合產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象。正向間接凝集反應(yīng)：將抗原先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生 的凝集反應(yīng)。反向間接凝集反應(yīng)：將特異性抗體先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗原結(jié) 合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。間接凝集抑制反應(yīng)：先將可溶性抗原加到相應(yīng)抗體中，使抗體先與該可溶 性抗原結(jié)合，則抗體就不能與致敏的顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)。若存在可溶性抗原，則 無(wú)凝集現(xiàn)象。概括免疫學(xué)技術(shù)主要內(nèi)容單克隆抗體制備的原理和基本過(guò)程基本原理：骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；而 抗原免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫脾 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成

17、的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具 有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限制增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體 的能力。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基含有次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶核苷(T) 中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡；未融合的骨 髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶吟阻斷，又因缺乏次黃嘌吟 -鳥(niǎo)嘌吟-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌吟完成DNA的 合成過(guò)程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了 HGPRT，因此能 在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)

18、，即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體?；具^(guò)程：1、抗原制備；一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較 強(qiáng)的抗原。2、免疫動(dòng)物；目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。3、免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；飼養(yǎng)細(xì)胞即在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的 或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖， 加入的細(xì)胞稱(chēng)之為飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder cell)。4、細(xì)胞融合；5、雜交瘤細(xì)胞的選 擇培養(yǎng)；6、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化；7、雜交瘤細(xì)胞的凍存；8、單克隆抗 體的檢定；9、分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；10、單克隆抗體大量制備。11細(xì)胞因子檢測(cè)的三大基本方法（原理、優(yōu)缺點(diǎn)

19、）細(xì)胞因子定義：是由活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并分泌的活性物質(zhì)，其 主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多 肽。免疫學(xué)檢測(cè)方一原性檢測(cè)：其原理是細(xì)胞因子與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合， 通過(guò)熒光素，酶等免疫標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行放大和顯示，從而定性或定量的顯示細(xì)胞因 子的水平。主要包括：ELISA；流式細(xì)胞分析法；ELISPOT1.優(yōu)點(diǎn)：特異性高，操作簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)：只測(cè)定量，不能定其活性；測(cè)定結(jié)果和抗 體來(lái)源和親和力有很大關(guān)系，使用不同來(lái)源和親和力的單抗，對(duì)同一標(biāo)本測(cè)定得 到的結(jié)果可能不同；敏感性不高；標(biāo)本中存在細(xì)胞因子受體，影響檢測(cè)結(jié)果；標(biāo) 本中存在細(xì)胞因子抗體或細(xì)胞因子載體

20、可干擾其測(cè)定。細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法一物活性檢測(cè):其原理是根據(jù)細(xì)胞因子對(duì)特定的依賴(lài)性 細(xì)胞株（即靶細(xì)胞）的促增殖作用，以增殖細(xì)胞中的DNA合成或酶活性為指標(biāo)， 間接推算出細(xì)胞因子的生物學(xué)活性單位。主要包括：細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗(yàn)；細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)；細(xì)胞毒試驗(yàn)；細(xì)胞趨化試驗(yàn) 分子生物學(xué)檢測(cè)方法一基因表達(dá)檢測(cè):其原理是從蛋白質(zhì)水平來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子 經(jīng)常因?yàn)榧?xì)胞因子含量低而受到限制，根據(jù)細(xì)胞因子的分泌表達(dá)是通過(guò)基因表達(dá) 的改變來(lái)調(diào)節(jié)的。利用細(xì)胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合 成寡聚核苷酸探針。檢測(cè)mRNA以反映基因表達(dá)和功能。主要包括：原位雜交技術(shù)；Northern印跡；核糖核酸酶保護(hù)分析

21、（RPA）； Rt-PCR技術(shù)特異性敏感性?xún)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)生物學(xué)方法低高可確定活性繁瑣費(fèi)時(shí)免疫學(xué)方法高較高易操作，可大量檢測(cè)不能確定是否有活性生物學(xué)方法高高既可定量又可定位不能反映濃度和活性12. FACS 法測(cè)CD分子的基本原理是在一組混合的細(xì)胞群中，加入特異的針對(duì)特定靶細(xì)胞表面分子的熒光標(biāo)記單克隆抗體，經(jīng) 抗原抗體反應(yīng)熒光標(biāo)記抗體停留在特定細(xì)胞的表面，稱(chēng)為熒光抗體標(biāo)記的靶細(xì)胞；將含有被 標(biāo)記細(xì)胞的混合細(xì)胞群混懸在一定容積的上樣緩沖液中，再通過(guò)FACS的進(jìn)樣吸管孔，儀器 就會(huì)將細(xì)胞懸液制成以單細(xì)胞排列的微細(xì)流束。當(dāng)每一個(gè)細(xì)胞通過(guò)儀器的激光束照射時(shí)，帶 在細(xì)胞上的熒光就會(huì)被相應(yīng)的激光束激活并發(fā)出對(duì)應(yīng)的熒光，通過(guò)敏感的光電倍增管即可檢 測(cè)到從細(xì)胞表面發(fā)出的熒光。根據(jù)測(cè)得的散射光可得到細(xì)胞大小及顆粒狀態(tài)的信息；而從熒 光的發(fā)射強(qiáng)度則提供了結(jié)合在細(xì)胞上的抗體信息，進(jìn)而也被反映了該細(xì)胞表面相應(yīng)分子