不同生育期靈芝子實(shí)體水提物與其免疫活性

1、不同生育期靈芝子實(shí)體水提物與其免疫活性分析 4 個(gè)靈芝 (Ganoderma) 菌株不同生育期子實(shí)體水提物的提取得率、多糖含量、多糖分子量分布和其對(duì)巨噬細(xì)胞 RAW264.7 NO 釋放量的影響。結(jié)果表明，隨著靈芝的生長(zhǎng)發(fā)育，其子實(shí)體水提物得率呈逐漸降低的趨勢(shì)， 水提物中多糖含量差異顯著。水提物經(jīng)透析后其多糖的分子量分布主要集中在 12 kDa 至25 kDa 之間，但不同生育期間的各分子量多糖的含量存在差異。芝蕾發(fā)育初期和成熟后期子實(shí)體水提物透析后的免疫活性較好。綜合考量，認(rèn)為成熟后期采收的靈芝子實(shí)體雖然多糖含量較低，但生物量較大， 可獲得較大量活性多糖， 所以確定成熟后期為適宜采收期。靈芝

2、； 子實(shí)體采收期； 水提物； 多糖含量； 分子量分布；NO#放量靈芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬(Ganoderma)真菌，作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥在民間已有上千年的應(yīng)用歷史， 并于 2000 年收入 中華人民共和國(guó)藥典，正式進(jìn)入我國(guó)的醫(yī)藥殿堂 1 。現(xiàn)代的藥理學(xué)研究證明， 多糖是靈芝的主要活性成分之一， 具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖和保肝等藥理作用 2 。以往研究?jī)H就不同發(fā)育時(shí)期的靈芝子實(shí)體中多糖含量進(jìn)行比較38 ，而關(guān)于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的子實(shí)體中多糖藥理活性的強(qiáng)弱是否有所不同， 多糖的種類是否有所變化， 尚未見(jiàn)報(bào)道。 目前，靈芝栽培中， 何時(shí)采收才能獲得活性成分含量高、 生物活性好的子

3、實(shí)體尚不明確。 本研究考察了不同生長(zhǎng)發(fā)育期的靈芝子實(shí)體水提物的得率、多糖含量、多糖分子量分布和刺激巨噬細(xì)胞 RAW264.7釋放NO量的能力，為確定活性多糖含量高且免疫活性好 的靈芝子實(shí)體采收時(shí)期提供科學(xué)依據(jù)。材料與方法供試菌株赤芝 （G. lucidum ） 164、 119-2 、 ck 和松杉靈芝（G.tsugae ）140 菌種保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。? 喋？料70%棉籽殼，18%麩皮，10%木屑，1%蔗糖，1%石膏粉，含水量為60%65%。? o赴？株RAW 264.7細(xì)胞株（小鼠巨噬細(xì)胞株）購(gòu)自美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心（ATCC）。? （T 瞧？主要實(shí)驗(yàn)儀器包括紫外-可見(jiàn)光

4、分光光度計(jì)（Amersham司）、 Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀（ Bio-Tek 公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman-Coulter公司） 、 高效液相色譜 （Waters 公司） 、 超低溫冰箱（Thermo Forma公司）、超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器 XX公司）、Bu chi VacuumController V-800旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Bu chi公司）和冷凍干燥儀Thermo Savant 公司）。? K 約？25、 50、 80、 150、 270、 410、 670 kDa 的葡聚糖 ( Dextran ) 標(biāo)準(zhǔn)品為 Fluka

5、 公司產(chǎn)品，青霉素和鏈霉素(雙抗)為 Amersco 公司產(chǎn)品，DMEM RPMI-1640、胎牛血清、胰酶為 Gibco公司產(chǎn) 品，細(xì)菌脂多糖( Lipopolysaccharide, LPS )、磺胺、鹽酸萘 乙二胺為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭PL傀沖液：用去離子水配制 0.1 mol/L NaH2P04和0.3 mol/L NaNO3 用 1 mol/L 的 NaOH#液將 pH調(diào)至 7.0 ,并加入 5 mL NaN3(10 mg/mD ,使用前用0.45以m的濾膜抽濾，并超聲 20 min 脫氣。DMEMg全培養(yǎng)基：取 DMEM 13.5 g,用無(wú)菌超純水定容

6、至 1 L,充分溶解后，加入 NaHCO3 3.7 g,同時(shí)分別加入青霉素和鏈 霉素至濃度為30以g/mL和100以g/mL,用NaOHM節(jié)pH至7.2 , 過(guò)0.22以m濾膜后分裝，于4 C保存，使用時(shí)加入10%M活的 胎牛血清。RPMI-1640培養(yǎng)液：取 RPMI-1640 16.2 g,用無(wú)菌超純水定 容至1 L ,充分溶解后，加入 NaHCO32 g青霉素和鏈霉素的添 加、pH調(diào)節(jié)、過(guò)濾膜分裝以及保存、使用均同DMEMS全培養(yǎng)基。Griess test reagent ： 6.25 mL H3PO4 加入到 250 mL 蒸餾 水中，再分別加入2.5 g 磺胺和 0.25 g 鹽酸萘

7、乙二胺，然后使用磁力攪拌器攪拌至磺胺和鹽酸萘乙二胺全部溶解， 棕色試劑瓶4 冰箱保存。PBS容液：0.14 mol/L NaCl, 0.0027 mol/L KCl, 0.004 mol/LNa2HPO，4 0.002 mol/L KH2PO4 ， pH 7.4 。? W 椒？?小郵堤迦O?靈芝栽培采用常規(guī)袋料栽培方法 9,10 ， 4 個(gè)供試菌株分別于 2007 年 4 月上旬在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種廠制種，于 5 月上旬菌絲滿袋后移至上海市崇明縣堡鎮(zhèn)向陽(yáng)新村 66號(hào)大棚中培養(yǎng)出菇。 自 6 月 6 日現(xiàn)蕾開(kāi)始采收第一批樣品， 以后每 3 d 采集一次樣品，截至 6 月 30 日采

8、收第 9 批樣品后，再于7月 10 日采收最后一批樣品，共10個(gè)批次。根據(jù)靈芝生長(zhǎng)發(fā)育 TOC o 1-5 h z 不同時(shí)期的形態(tài)特征，將采收的 10 個(gè)批次樣品大致劃分為5 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，具體見(jiàn)表1。馮 娜，等：不同生育期靈芝子實(shí)體水提物與其免疫活性? a櫓二？提物的制備采收的靈芝子實(shí)體樣品于 60 干燥至恒重，粉碎后過(guò)10目篩。每份樣品取6 g 于 240 mL 氯仿中靜置提取6 h ，重復(fù) 2次，合并提取液留作三萜含量和抗腫瘤活性的測(cè)定。殘?jiān)?0 干燥，再用 100 mL 蒸餾水于沸水浴中提取1 h ，重復(fù) 3 次。合并提取液，在旋蒸儀上減壓濃縮至20 mL后冷凍干燥，得靈芝子實(shí)體的水提取物，稱重。根據(jù)公式計(jì)算得率：得率=水提物重量(mcg) / 樣品重量(m x 100%?入？提物中多糖含量的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn) 11 的方法，苯酚- 硫酸比色法測(cè)定水提物中總糖含量， 3,5- 二硝基水楊酸比色法測(cè)定水提物中還原糖含量， 再根據(jù)公式計(jì)算水提物中多