兩種陸生植物浸提液對蛋白核小球藻

1、兩種陸生植物浸提液對蛋白核小球藻富營養(yǎng)化導(dǎo)致浮游植物尤其是微型藻類過度繁殖而爆發(fā)水華 , 引起一系列的環(huán)境問題 , 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 甚至危及人類健康 1-2. 而傳統(tǒng)的物理、 化學(xué)抑制藻類生長的方法會不可避免地破壞生態(tài)平衡并造成環(huán)境污染3, 因此尋求一種高效安全的抑藻方法具有重要意義. 利用植物間的化感作用控制水體藻類的繁殖作為一種生物方法, 具有安全不易造成二次污染的優(yōu)點(diǎn)4-7而備受關(guān)注. 化感作用是指包括微生物在內(nèi)的所有植物間生物化學(xué)方面的相互作用 8, 即一種植物通過向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)影響其它生物生長的現(xiàn)象8-9. 化感作用和化感物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)藻類的安全控制提供了一種新思路10

2、. 目前關(guān)于植物化感抑制藻類生長的研究主要集中于水生植物 11-15,陸生植物對微藻化感作用的研究相對較少. 合果芋葉和莖含乳汁 , 莖節(jié)有氣生根; 榕樹葉片和氣生根中也含有大量的乳汁 , 其中含具有化感作用的單寧和類萜 16-17. 合果芋和榕樹兩者都能無性繁殖, 較容易獲得 , 前者為典型的草本植物 , 后者為典型的常綠喬木, 兩者形成較鮮明對比 . 作者曾初步研究了合果芋對富營養(yǎng)化水體中氮、磷的凈化效應(yīng), 但關(guān)于這兩種植物的化感作用 , 尤其是化感抑藻作用的研究到目前為止未見報道. 因此本課題選取這兩種陸生植物 , 分別探討了不同種植物以及同種植物不同部位的浸提液對蛋白核小球藻的化感作用

3、 , 以探索不同類型陸生植物對微藻化感作用的差異性及其化感物質(zhì)的主要存在部位, 從而為陸生植物對微藻化感作用機(jī)理的研究提供科學(xué)依據(jù).材料與方法材 料浸提液的制備: 合果芋和榕樹均采自華僑大學(xué)校園內(nèi)花圃 .取新采集的合果芋莖、合果芋葉、榕樹葉、榕樹氣生根各100 g,置于 80 烘箱中干燥48 h, 用粉碎機(jī)粉碎 , 然后用 1 000 mL SE培養(yǎng)基 18 浸泡 , 置于恒溫 (25 ) 振蕩器中提取48 h, 離心去除殘渣，上清液先用普通濾紙過濾，再經(jīng)孔徑為0.22以m濾膜過濾除去顆粒雜質(zhì)和細(xì)菌后 , 得試驗(yàn)用浸提液母液, 濃度為 100gL-1.蛋白核小球藻: 蛋白核小球藻購于中國科學(xué)院

4、武漢水生所.試驗(yàn)前將小球藻接種于新配置的SE培養(yǎng)基,使之達(dá)指數(shù)生長期后用于試驗(yàn).方 法浸提液抑藻試驗(yàn)方法取浸提液母液，用滅菌過的SE培養(yǎng)基稀釋為10、20、30、50 gL-1 4 個濃度梯度, 取處于指數(shù)生長期的蛋白核小球藻接種于高溫滅菌過的 250 mL 三角瓶內(nèi) , 接種后藻液總體積為250 mL.試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù),在PYX-250Q-B型人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行,培養(yǎng)條件為溫度25 , 光照 3 0004 000 lx, 相對濕度為 70%,光暗比12 h ： 12 h.試驗(yàn)期間每天定時搖瓶 2次，同時隨機(jī)調(diào)換三角瓶放置位置.每天用血球計數(shù)板在顯微鏡(16X40倍)下計藻細(xì)胞數(shù) .試驗(yàn)干擾的消

5、除浸提液對蛋白核小球藻的化感作用整個試驗(yàn)過程均在人工氣候箱中進(jìn)行, 能夠確保其最適生長溫度(25 )和較適的光照條件 (3 0004 000 lx).pH 值作為藻類生長環(huán)境的重要理化指標(biāo) ,無論在自養(yǎng)或異養(yǎng)條件下都隨代謝過程發(fā)生變化 . 研究結(jié)果表明小球藻能在偏酸性或偏堿性的環(huán)境中生長19, 其最適生長的 pH值為6.08.0.試驗(yàn)過程中pH值的變化在6.138.05,因此認(rèn)為培養(yǎng)基的酸堿度不是限制小球藻生長的主要影響因子. 試驗(yàn)過程中TP、TN濃度變化范圍分別為：0.3290.607 mgL-1和1.0162.175 mgL-1,變化幅度較小，這一濃度范圍的 MP 均能較好地滿足蛋白核小球

6、藻生長的需求; 對試驗(yàn)器皿進(jìn)行高溫滅菌以及浸提液用0.22以m的微孔濾膜過濾除菌，排除了微生物的干擾 , 進(jìn)一步確定化感作用為抑制藻類生長的主要限制因素.數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.化感組分對蛋白核小球藻的相對抑制率計算公式如下 :IR%=(1-N/N0)X100%,其中 ,IR 為相對抑制率;N 為加入化感組分試驗(yàn)組的藻密度(個/mL);N0為對照組藻密度.半效應(yīng)濃度EC50的計算：用生長面積法20計算96 h EC50;A=(N1-N0)/2 xt1+(N1+N2-2N0)/2 X(t2- t1)+ +(Nn-1+Nn-2N0)/2 X(tn -tn-1),式中

7、,A 為生長曲線以下面積 ;Nn 為 tn 時刻細(xì)胞密度;tn 為試驗(yàn)開始后第 n 次計數(shù)時間 ;IA 為生長抑制百分率,IA=(Ac- At)/Ac xi00%;Ac為空白組生長曲線以下面積；At為 受試濃度生長曲線以下面積.以 IA 為縱坐標(biāo) , 以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖 ,IA 值為50%所對應(yīng)的濃度即為EC50值.結(jié)果與分析合果芋浸提液對蛋白核小球藻的化感作用合果芋葉浸提液對蛋白核小球藻的化感作用圖 1 為不同濃度合果芋葉浸提液對蛋白核小球藻生長曲線和相對抑制率變化情況. 由圖 1 可知 , 合果芋葉浸提液前4 d 對蛋白核小球藻的生長具有一定的抑制作用 , 藻密度始終低于對照組且大致隨

8、浸提液濃度的增大, 抑制作用增強(qiáng). 以初始藻密度為2.5 X 106個/mL分別接種于幾個濃度梯度浸提液處理組中,試驗(yàn)開始 1 d,10 、 20、 30、 50 gL-1 濃度浸提液對蛋白核小球藻均表現(xiàn)出了抑制作用,藻密度值均低于對照組 4.1 X 106個/mL, 各濃度浸提液對蛋白核小球藻相對抑制率分別為41.5%、51.2%、 52.4%和 75.6%;其后 , 隨培養(yǎng)時間的延長, 相對抑制率大致呈下降趨勢, 第 4天浸提液濃度為 10 gL-1 和 50 gL-1 處理組藻密度分別為5.4 X 106個/mL和3.5 X 106個/mL,相對抑制率分別為28.9%和 53.9%. 可

9、能是因?yàn)榻嵋褐杏行У幕薪M分不穩(wěn)定, 在水體中分解轉(zhuǎn)化而濃度降低, 或者其中一部分被小球藻吸收并轉(zhuǎn)化為其同化產(chǎn)物 , 因而對小球藻的抑制效果減弱 ;6 天后合果芋葉浸提液對蛋白核小球藻表現(xiàn)出促進(jìn)作用 , 大致是浸提液濃度越低促進(jìn)效果越強(qiáng).第6天藻密度最大值和最小值分別為21.0X106個/mL(10 gL-1 浸提液組)和 12.9 X 106 個/mL(50gL-1 浸提液組 ), 對應(yīng)的相對抑制率分別為 -112.1%和-33.3%. 這可能是因?yàn)榛薪M分分解轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物促進(jìn)了蛋白核小球藻的生長.2.1.2 合果芋莖浸提液對蛋白核小球藻的化感作用圖 2 為不同濃度合果芋莖浸提液對蛋白核小

10、球藻生長曲線的影響 (a) 和抑制率的變化情況(b). 由圖 2 可知 , 與合果芋葉浸提液相似 , 試驗(yàn)初期 , 莖浸提液對小球藻表現(xiàn)出抑制作用 ,3d 后各濃度浸提液組均表現(xiàn)出促進(jìn)作用 .以初始藻密度為2.5 X 106個/mL分別接種于幾個濃度梯度浸提液處理組中 , 實(shí)驗(yàn)開始 1 d,10 、 20、 30、 50 gL-1 浸提液處理組藻密度均低于對照組4.1 X 106個/mL,相對抑制率均達(dá)到最大值, 分別為43.9%、 53.7%、 56.1%和 78.0%,與合果芋葉浸提液相似, 隨浸提液濃度的增大, 抑制作用增強(qiáng), 但莖浸提液對小球藻的抑制作用不如葉浸提液持久, 可能是合果芋

11、莖所含的化感物質(zhì)成分比葉更不穩(wěn)定. 第 2 天開始莖浸提液的抑制作用逐漸減小 , 低濃度的浸提液相對抑制率均為負(fù)值, 表現(xiàn)出促進(jìn)作用 ,3d 后各濃度浸提液處理組均表現(xiàn)出促進(jìn)效果 . 與合果芋葉浸提液不同 , 莖浸提液濃度越大, 促進(jìn)作用越明顯. 藻密度最大值和最小值分別為8.9 X 106個/mL(30 gL-1 浸提液組)和6.5 X 106個/mL(50 gL-1 浸提液組)，對應(yīng)的相對抑制率分別為 -47.1%和-7.4%. 從總的變化趨勢來看, 浸提液先表現(xiàn)出抑制作用 , 而后具有促進(jìn)作用 , 且浸提液濃度越大促進(jìn)作用越明顯 .造成這種現(xiàn)象的可能原因是由于隨培養(yǎng)時間的延長, 培養(yǎng)混合

12、液中有效的化感物質(zhì)濃度逐漸下降 , 對藻類的抑制作用減弱 18,而浸提液中的某些其他成分則可能被小球藻吸收利用 , 為其提供營養(yǎng) , 浸提液濃度越大, 營養(yǎng)成分越多 , 因而表現(xiàn)出快速增長趨勢.2.2 榕樹浸提液對蛋白核小球藻的化感作用榕樹葉浸提液對蛋白核小球藻的化感作用圖 3 為榕樹葉浸提液對蛋白核小球藻生長曲線的影響 (a) 和抑制率 (b). 由圖 3 可知 , 與合果芋葉和莖浸提液不同 , 除個別情況外 , 總體上榕樹葉浸提液對蛋白核小球藻顯示了較強(qiáng)的抑制作用 , 且隨時間的延長相對抑制率逐漸增大. 浸提液濃度越大抑制作用越強(qiáng).以初始藻密度為2.0 X 106個/mL分別接種于幾個濃度

13、梯度浸提液處理組中 , 試驗(yàn)第 1 天,20 gL-1 浸提液組小球藻密度為2.6 X 106個/mL,與對照組藻密度 2.5 X 106個/mL無 明顯差異 (P0.05), 而 10 gL-1 和 30 gL-1 浸提液組小球藻生長受到較強(qiáng)的抑制,藻密度分別為2.05 X 106個 /mL和2.1 X 106個/mL,與對照組差異顯著(P6個/mL.第5天相對 抑制率分別達(dá)33.8%、 72.5%和 91.3%.圖 4 為榕樹氣生根浸提液對蛋白核小球藻生長曲線的影響(a) 和抑制率變化情況(b). 由圖 4 可知 , 除 10 gL-1 浸提液組第 2 天和 20 gL-1 浸提液組第 4

14、 天外 , 各濃度榕樹氣生根浸提液處理組蛋白核小球藻生長均受到一定的抑制作用 , 但與榕樹葉浸提液不同的是氣生根浸提液對小球藻的抑制作用不隨浸提液濃度的增大而增強(qiáng) , 作用效果更加復(fù)雜,10gL-1 榕樹氣生根浸提液處理組化感抑制效果較好. 以初始藻密度為2.0 X 106個/mL分別接種于幾個濃度梯度浸提液處理組中 , 試驗(yàn) 1 d,10 、 20、 30 gL-1 榕樹氣生根浸提液組小球藻的生長均受到一定的抑制 , 藻密度均低于對照組4.15 X 106個/mL,相對抑制率分別為 30.1%、47.0%和40.0%.第5 天浸提液濃度10、 20、 30 gL-1 處理組藻密度分別為5.0

15、X105j/mL、1.34 X107 個/mL 和 1.17 X 107 個/mL,抑制率 分別達(dá)96.3%、 1.5%和 14.0%.2.3 兩種陸生植物不同部位浸提液對蛋白核小球藻抑制效果比較EC5m直與浸提液對藻類的抑制能力成反比,即EC50越小,表. 圖 5 為兩種陸生植物不同部位浸提液對蛋白核小球藻的EC50,96h值(由于合果芋莖浸提液1 d 后較低濃度浸提液組表現(xiàn)出了促進(jìn)作用 , 化感抑制蛋白核小球藻的持續(xù)時間較短, 未計算EC50,96h 值).由圖5可知，合果芋葉浸提液對蛋白核小球藻的EC50,96h值略大于榕樹葉浸提液, 說明榕樹葉浸提液抑制蛋白核小球藻的效果略好于合果芋葉

16、浸提液; 榕樹氣生根浸提液對蛋白核小球藻的EC50,96h值大于榕樹葉浸提液,說明榕樹葉片中起化感抑制作用的化感組分含量多于氣生根. 總體上 , 化感作用由強(qiáng)到弱順序?yàn)?,榕樹葉 (EC50,96h 為 13.16 gL-1) 合果芋葉 (EC50,96h為 14.37 gL-1) 榕樹氣生根(EC50,96h 為 30.66gL-1). 就浸提液對蛋白核小球藻的相對抑制率和蛋白核小球藻生長曲線變化情況綜合考慮可以得出合果芋莖浸提液化感抑制作用效果不及合果芋葉浸提液強(qiáng) , 但差異不顯著 ( 對第 1 TOC o 1-5 h z 天后合果芋葉和莖浸提液對蛋白核小球藻的相對抑制率進(jìn)行t檢驗(yàn) ,P0

17、.05).討論不同濃度浸提液對蛋白核小球藻化感抑制效果差別較大. 在起抑制作用的期間內(nèi), 對于合果芋葉、莖和榕樹葉浸提液來說,隨浸提液濃度的增大, 浸提液對蛋白核小球藻生長的抑制作用增強(qiáng) , 表現(xiàn)出濃度效應(yīng) . 榕樹氣生根浸提液較為特殊, 較低濃度浸提液(10 gL-1) 組化感作用抑制效果較好. 鏡檢觀察到投加低濃度榕樹氣生根浸提液組藻液中含有大量的浮游動物 , 而浮游動物的吞噬作用也是浸提液抑藻的一個重要機(jī)制 15. 榕樹作為一種重要的藥材原料, 許多種成分如黃酮類和內(nèi)酯類化合物具有抑菌效果 , 過高的浸提液含較多的抑菌成分, 可能又反過來抑制浮游動物的產(chǎn)生和繁殖, 因而較低濃度表現(xiàn)出較好

18、的抑制效果.合果芋和榕樹不同部位浸提液對蛋白核小球藻的化感作用試驗(yàn)結(jié)果顯示, 合果芋葉浸提液對蛋白核小球藻的化感抑制效果比莖略好 , 但差別不明顯. 而榕樹葉浸提液對蛋白核小球藻的化感作用顯著強(qiáng)于榕樹氣生根浸提液, 這與李鋒民等21 的研究結(jié)果相似 . 化感物質(zhì)是植物體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝物 , 而植物體內(nèi)的有機(jī)物主要在葉片中通過光合作用合成. 試驗(yàn)結(jié)果也顯示, 榕樹葉片浸提液對蛋白核小球藻的抑制作用強(qiáng)于其它部位浸提液, 因此認(rèn)為化感物質(zhì)很可能主要是在植物葉片中合成, 然后向下運(yùn)輸至根部釋放到環(huán)境中后起作用 （ 也可以通過淋溶或揮發(fā)作用等方式釋放 ）, 但化感組分在從葉片運(yùn)輸?shù)狡渌M織的過程中 ,

19、 合果芋葉片化感組分較容易運(yùn)輸?shù)角o組織 , 而榕樹葉片化感組分相對而言卻較難運(yùn)輸?shù)綒馍M織 . 兩者運(yùn)輸途徑存在差異, 但這還值得進(jìn)一步深入研究 .合果芋葉和莖浸提液對蛋白核小球藻的化感作用呈現(xiàn)先抑制而后具一定促進(jìn)作用的效果 , 這與門玉潔等18 人的研究結(jié)果類似 . 原因可能是: 浸提液化感組分投加到藻類培養(yǎng)基后 , 起作用的化感物質(zhì)不穩(wěn)定, 其自身在水溶液中易降解; 或者會被藻細(xì)胞產(chǎn)生的抗性物質(zhì)降解, 甚至被藻細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)化為微藻能夠利用的物質(zhì) , 為其提供營養(yǎng), 因而隨培養(yǎng)時間的延長, 培養(yǎng)混合液中起抑制作用的化感組分的濃度逐漸下降 , 對藻類的抑制作用也就逐漸減弱 . 同時 , 其代謝或轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物也可能對蛋白核小球藻產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用 . 與合果芋不同 , 榕樹葉和氣生根浸提液對蛋白核小球藻的化感作用呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的抑制效果 . 可能是因?yàn)殚艠淙~或氣生根組織中含大量的乳汁 , 其中有類萜物質(zhì) , 它們對藻類具