乳酸脫氫酶活力測(cè)定精

1、乳酸脫氫酶活力測(cè)定精目的要求1學(xué)習(xí)LDH活力測(cè)定原理；2測(cè)定動(dòng)物肌肉組織提取液LDH活力及比活力。原理乳酸脫氫酶lactate dehydrogenase，簡(jiǎn)稱LDH廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)，是糖代謝酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，可催化如下反響： LDH 乳酸 +NAD+ 丙酮酸+NADH+H+LDH可溶于水或稀鹽溶液，可制備組織勻漿，經(jīng)浸泡、離心，得上清為組織提取液。LDH測(cè)定方法很多，紫外分光光度法最為簡(jiǎn)便快速。鑒于NADH和NAD+在340nm和260nm處有各自最大吸收峰值，因此以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類都可通過(guò)340nm光吸收值的改變，定量測(cè)定酶的含量。本實(shí)驗(yàn)反響液中含丙酮酸及

2、NADH，在一定條件下參加一定量酶液，觀察NADH在反響過(guò)程中340nm處光吸收減少值，減少越多，那么LDH活力越高。其活力單位定義為：在25 ，條件下A340nm/min下降為1.0的酶量為1個(gè)單位?？啥繙y(cè)定每克濕重組織中LDH單位，定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量即可計(jì)算比活力U/mg。試劑與器材材料：動(dòng)物的肌肉、肝、心、腎等組織。勻漿緩沖液：10m mol/L pH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液。酶活力測(cè)定試劑：10.1mol/L pH7.5 磷酸緩沖液 (PB)100ml；2NADH溶液：3.5mg純NADH以0.1mol/L pH7.5 PB 1ml稀釋。3丙酮酸溶液：2.5mg丙酮酸鈉，以

3、以0.1mol/L pH7.5 PB 29ml稀釋。試劑23最好在臨用前配制。操作方法一制備肌肉勻漿二LDH活力測(cè)定三蛋白質(zhì)含量測(cè)定四數(shù)據(jù)處理一制備肌肉勻漿取瘦豬肉或兔肉一塊除去脂肪及筋膜等，稱取20g，按W/V=1/4比例參加4預(yù)冷的10m mol/L pH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，用組織搗碎機(jī)搗碎，每次10s，連續(xù)3次。將勻漿液倒至燒杯中，置4冰箱提取過(guò)夜，過(guò)濾后的紅色液體為組織提取液，量總體積。二LDH活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)預(yù)先將丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 水浴中預(yù)熱。取2只光徑為1cm的石英比色皿，在一只比色皿中參加0.1mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液3ml，置紫外分光光度

4、計(jì)中，于340nm處調(diào)A值為0；另一只比色皿用于測(cè)定LDH活力，依次參加2.9ml丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加蓋搖勻后測(cè)定A340nm340nm，連續(xù)測(cè)定3min。以A對(duì)時(shí)間作圖，取最初線性局部，計(jì)算 A340nm/min減少值。三蛋白質(zhì)含量測(cè)定將組織提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)約1：20，取0.1ml按Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。四數(shù)據(jù)處理每毫升組織提取液中LDH活力單位：LDH比活力 總LDH活力U比活力U/mg= 總蛋白含量mg A340nm/min 稀釋倍數(shù)LDH活力單位U/ml提取液= 酶液參加量 10l 10-3提取液中LDH總活力單位= LDH活力U/ml 總體積本卷須知1、實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡量新穎，如取材后不立即用，應(yīng)貯存在-20 低溫冰箱中。2、酶液的稀釋度及參加量應(yīng)控制A340/nm下降在0.1-0.2之間，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，參加酶液后應(yīng)立即計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確記錄每隔0.5min A340下降值。3、NADH溶液應(yīng)在臨用前配制，如其純度為75%，那么應(yīng)折合