血栓與止血檢驗進(jìn)展

1、血栓與止血檢驗進(jìn)展1 近年，隨著基礎(chǔ)理論和實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，血栓與止血的檢驗方法及其臨床應(yīng)用也有很大的進(jìn)展，下面就近年來血栓與止血檢驗的進(jìn)展作一簡述。2（一）血小板微顆粒檢測 血小板被激活后，它以出芽方式形成囊泡或以偽足斷裂方式形成血小板顆粒（platelet micropaticle, PMP）。 PMP的體積較正常血小板為小，但有完整的血小板膜結(jié)構(gòu)和功能。 檢測血循環(huán)中的PMP可較完整地反映血小板參與血栓形成和血液凝固的功能。 3檢測方法：流式細(xì)胞術(shù)或微顆粒捕獲法。參考值：5815/104PLT（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院）（一）血小板微顆粒檢測4（一）血小板微顆粒檢測臨床意義：PMP主要反映血小

2、板活化或破壞，用于動脈血栓性疾病的檢測，它是動脈血栓形成的敏感和特異的分子標(biāo)志物。 1.急性冠脈綜合征（ACS） PMP 2.腦血栓形成 PMP 3.ITP出血的判斷指標(biāo) 4.PNH患者PMP 5.腫瘤患者PMP5（二）血小板-白細(xì)胞聚集體檢測 血小板被激活后，血小板釋放P-選擇素（P-selectin或GMP-140）。P-選擇素與白細(xì)胞和（或）單核細(xì)胞膜上的P-選擇素配體糖蛋白-1（PSLG-1）結(jié)合形成血小板-白細(xì)胞聚集物和（或）血小板-單核細(xì)胞聚集物，是反映動脈血栓形成的特異性標(biāo)志物之一。6檢測方法：流式細(xì)胞術(shù)。參考值：15.38.5（PLA/L）瑞典報道 。臨床意義：動物實驗和臨床研

3、究表明，血小板-白細(xì)胞聚集物是更敏感和更特異的血栓標(biāo)志物。 在胸痛患者中，血小板-白細(xì)胞聚集體水平為AMI胸痛組非AMI胸痛組正常對照組；分別為34.210.319.31.415.38.5（二）血小板-白細(xì)胞聚集體檢測7（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性檢測 生理情況下，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的血管性血友病因子（vonWillebrand factor，vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（vWF cleaving proteinase,vWF-CP）的調(diào)節(jié)。使vWF不能過度地參與血小板的黏附和聚集。因此vWF-CP是限制血栓形成的指標(biāo)之一。8（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性檢測 vWF-CP為金

4、屬蛋白酶ADAMTS亞家族中的一個成員（ADAMTS-13） 9檢測方法：ELISA法。參考值：83例正常人 （1）血漿（n30） vWF：CBA為2.140.5（21.99.2） （2）血清（n53） vWF：CBA為2.452.0（20.510.8）（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性檢測10臨床意義：1.血栓性血小板減少性紫癜-溶血性尿毒癥 綜合征（TTP-HUS）：vWF-CP基因缺陷 或存在抗vWFCP自身抗體,故vWF-CP, 使超大vWF不能降解，導(dǎo)致血栓形成。 其特異性97，敏感性100。2. 血管性血友?。╲WD）：血漿 vWF-CBA水平明顯低于正常。3. 惡性腫瘤： vW

5、F-CP活性水平顯著低于正常（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性檢測11（四）雙相APTT（biphasic APTT）檢測 凝血是一個動態(tài)變化的過程，而傳統(tǒng)的APTT檢測只能提供血液凝固時間這一單個的信息。 雙相APTT檢測，是在常規(guī)APTT檢測的基礎(chǔ)上，聯(lián)合利用光度計和分析軟件，全程記錄血漿凝固前后濁度的變化，并且繪制血液凝固過程中的透光度的波形變化圖，可以提供在纖維蛋白聚集體形成之前凝血時間、速率、加速度的變化的多種量化的信息。12（四）雙相APTT（biphasic APTT）檢測 檢測方法：法國生物梅里埃（bioMerieux）公司的MDA血凝分析儀。 雙相APTT透射波形圖(A:

6、正常; B: DIC) 13（四）雙相APTT（biphasic APTT）檢測臨床意義： 對診斷pre-DIC特別有價值。敏感性為97.6，特異性為98。 大于50的患者在DIC前18h就出現(xiàn)雙相APTT的變化。14（五）凝血酶激活的纖溶抑制物檢測 凝血酶激活的纖溶抑制物（thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI）由肝臟合成 ，經(jīng)凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（T-TM）作用后變成活化型的TAFI。 TAFI具有抑制纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的生物活性，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑制。15（五）凝血酶激活的纖溶抑制物檢測16檢測方

7、法： TAFI: Ag ELISA法 TAFI: A 發(fā)色底物法 參考值：（上海瑞金醫(yī)院） TAFI: Ag（n34）為7728（21133）； TAFI: A（n34）為245mg/L（1434g/L）。（五）凝血酶激活的纖溶抑制物檢測17臨床意義： TAFI: Ag和TAFI: A水平升高：見于深靜脈血栓（DVT）、動脈血栓（冠心?。?、微血栓（DIC），其他 TAFI水平升高還見于感染、炎癥、FV Leiden突變。 TAFI水平降低：見于某些凝血因子減少（如血友病、FXI減低），急性早幼粒細(xì)胞白血?。═AFI: A減低66，TAFI: Ag正常）。 （五）凝血酶激活的纖溶抑制物檢測18（

8、六）可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體檢測 可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（soluble endothelial protein C receptor, sEPCR）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，部分與內(nèi)皮細(xì)胞連接稱膜連EPCR，一部分游離于血漿稱sEPCR。 血漿中sEPCR與膜連的EPCR具有相反的作用。sEPCR可與PC和APC結(jié)合，抑制PC的活化和抑制APC的抗凝活性，減輕膜連EPCR的增強(qiáng)PC活化和APC的抗凝作用，所以血漿sEPCR水平的增高是反映血管損傷和抗APC抗凝作用的特異性標(biāo)志物。19（六）可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體檢測20檢測方法：雙抗體夾心ELISA法。參考值： 血漿sEPCR為1

9、15.220.7g/L。臨床意義：血漿sEPCR水平的增高是反映血管損傷和抗APC抗凝作用的特異性標(biāo)志物。安徽省立醫(yī)院的結(jié)果見下表。（六）可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體檢測2122（七）蛋白C Global試驗 凝血酶（T）與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（TM）形成復(fù)合物（T-TM），后者使蛋白C（PC）形成活化蛋白C（APC）。APC在蛋白S（PS）的輔助下，滅活因子Va和因子VIIIa，還抑制纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）使纖溶活性增強(qiáng)。此外，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM復(fù)合物直接激活PC，使PC轉(zhuǎn)化為APC，APC也受PCI的抑制。23（七）蛋白C

10、 Global試驗 24檢測方法：在待測血漿中加入蛇毒溫育，蛇毒可直接激活PC轉(zhuǎn)變?yōu)锳PC。隨后加入APTT試劑以檢測依賴PC活性的血漿凝固時間（Protein C activity-dependent clotting time，PCAT）。若待測血漿中的PC系統(tǒng)正常，則加入Ca2+后血漿凝固時間顯著延長。為了避免諸多因素的影響，本試驗設(shè)計了對照組，即在試驗過程中以緩沖液代替PC激活劑，血漿不依賴PC活性的血漿凝固時間（PCAT/O），其結(jié)果應(yīng)短于60秒。（七）蛋白C Global試驗25參考值： PCAT為85200秒，PCAT/O為3355秒（n234） 臨床意義： 本試驗多用于蛋白C、

11、蛋白S、FV Leiden突變和FII 20210 GA突變的檢測，起到蛋白C系統(tǒng)篩選檢測作用。 本試驗也有假陽性，見于凝血因子V、VIII活性升高、口服抗凝劑和狼瘡抗凝物等。 （七）蛋白C Global試驗26（八）蛋白Z抗原檢測 蛋白Z（protein Z，PZ）是二十世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種血液凝固調(diào)節(jié)蛋白，為一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，由肝臟合成后分泌入血。在Ca2+和磷脂存在時，PZ可與蛋白Z依賴的凝血酶抑制物（protein Z-dependent protase inhibitor，ZPI）結(jié)合，并進(jìn)一步與FXa形成Xa-ZPI-PZ復(fù)合物而使因子Xa在一分鐘內(nèi)失去95以上的凝血

12、活性。27（八）蛋白Z抗原檢測 檢測方法：ELISA法 參考值：法國學(xué)者報道為1.043.57mg/L。 臨床意義： 目前PZ在臨床上的意義尚不十分明了。 Wasse等研究發(fā)現(xiàn)PZ缺乏（1.0 mg/L）在缺血性腦卒中和健康對照中分別為20和5，二者具有顯著性差異，PZ缺乏可使缺血性腦卒中的危險性提高4倍。 Sofi等報道在急性冠脈綜合征病人當(dāng)中PZ水平明顯低于健康對照，說明PZ缺乏是導(dǎo)致急性冠脈綜合征的獨立的危險因素。 28（九）谷氨酸型纖溶酶（原）檢測（Glu- Pln或Glu-Plg） 在微量纖溶酶（Pln）作用下，纖溶酶原（Plg）NH2端的精（68）-蛋（69）及賴（77）-賴（78

13、）-纈（79）被裂解，生成谷氨酸型纖溶酶原（Glu-Plg或Glu- Pln）和賴氨酸型纖溶酶原（Lys-Plg或Lys-Pln）。Glu-Plg約占90，Lys-Plg僅占10。29（九）谷氨酸型纖溶酶（原）檢測（Glu- Pln或Glu-Plg）檢測方法：人血漿Glu-Plg（Glu-Pln）用雙抗體夾心ELISA法檢測?？笹lu-Plg（NH2端165aa）抗原表位的單抗（LW5G5）作為包被抗體，抗Plg（Pln）重鏈區(qū)單抗（LW10F7）作為酶標(biāo)記抗體，二者構(gòu)建人血漿Glu-Plg（Pln）雙抗體夾心ELISA檢測方法。參考值：213.945.8mg/L （n=220，上海第二醫(yī)科大

14、學(xué)，醫(yī)學(xué)檢驗重點實驗室）。30（九）谷氨酸型纖溶酶（原）檢測（Glu- Pln或Glu-Plg）臨床意義：Glu-Plg（Pln）水平降低，反映纖溶酶原激活物（t-PA、u-PA）活性增強(qiáng)。見于原發(fā)性纖溶，重癥肝病、肝硬化、肝葉切除術(shù)、門脈高壓、肝移植、大型手術(shù)，前置胎盤、胎盤早剝、死胎滯留、妊高征、羊水栓塞，惡性腫瘤播散、嚴(yán)重感染，以及各種原因所致DIC等。31（十）流式細(xì)胞術(shù)在血栓與止血檢驗中的應(yīng)用（一）檢測血小板功能缺陷癥1. 血小板計數(shù)(Plt) 尤其對Plt低的患者特別有用，誤差5%。2. 原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP) 對ITP，血小板表面免疫球蛋白(pAIg)增加，血小板顆粒(

15、PMPS)增加，網(wǎng)織血小板增多。3. 血小板無力癥 血小板Gp IIb/IIIa減少, GP IIb/IIIa與纖維蛋白原(Fg)結(jié)合能力減低。4. 巨大血小板綜合征 血小板Gp Ib/IX表達(dá)減少。5. 血管性血友病(vWD) 利用抗vWF單抗可以檢測vWF與GPIb的結(jié)合能力減低32（十）流式細(xì)胞術(shù)在血栓與止血檢驗中的應(yīng)用（二）檢測血栓性疾病 可以反映血小板激活的程度。血小板激活時，抗GP IIb/IIIa、抗P-選擇素(GM-140)、抗53FD溶酶體和抗110 000溶酶體等單抗，在血小板膜上表達(dá)增多，但抗GP Ib/IX結(jié)合力減低。血小板P-選擇素與纖維蛋白原結(jié)合能力增加。33（十一

16、）抗體芯片技術(shù) 抗體芯片（Antibody Microarray），是蛋白芯片的一種，是將能識別特異抗原的抗體制成微陣列，檢測生物樣品中抗原蛋白表達(dá)模式的方法。這種抗體微陣列可以在一次簡單實驗中同時檢測樣品中的數(shù)百甚至數(shù)千種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并且可以在一張芯片上對兩種樣品的表達(dá)模式進(jìn)行比較分析。這使得抗體芯片在疾病研究和藥物開發(fā)上有廣泛的應(yīng)用前景。34（十一）抗體芯片技術(shù) 抗體芯片技術(shù)在血栓與止血檢驗領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。目前正在研發(fā)過程中的出凝血疾病診斷抗體芯片，是將針對各種凝血因子和抗凝血因子的單克隆抗體分別固定在合適的片基上，來檢測血清標(biāo)本中各種凝血因子和抗凝血因子的抗原，從而可以迅速診斷遺傳性易栓癥和出血性疾病。35（十二）植入前單細(xì)胞基因診斷 植入前診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是輔助生殖技術(shù)與遺傳學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種孕前診斷技術(shù)。 基本思路：體外受精后發(fā)育至68細(xì)胞期的胚胎在顯微操作下活檢12個單卵裂球細(xì)胞進(jìn)行基因或染色體分析，選擇正常胚胎植入宮內(nèi)，從而獲得健康胎兒。36（十二）植入前單細(xì)胞基因