基因功能研究常用方法

1、關(guān)于基因功能研究常用方法第一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 弄清基因的生物學(xué)功能,才能明確基因在疾病發(fā)生中的具體作用、弄清疾病發(fā)生的分子機制。常用的基因功能研究技術(shù)包括：（1）DNA克隆技術(shù)（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)和核轉(zhuǎn)移技術(shù)（動物克隆）（3）基因敲除技術(shù)（4）反義技術(shù)（5）RNA干涉技術(shù)第二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) DNA克隆技術(shù)第三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆第四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)水平：

2、分子克隆 即DNA 克隆 細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮┑谖鍙?，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子。 也稱基因克隆或重組DNA 。 第六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic e

3、ngineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。第七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶第八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)中常用的工具酶第九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）目的基因 cDNA基因組DNA目的基因 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）第十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋

4、白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。第十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于

5、2022年6月1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 第十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2. 噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 粘性質(zhì)粒(cosmid)第十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細菌人工染色體 (ba

6、cterial artificial chromosome, BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、重組DNA技術(shù)基本原理克隆基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達 第十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程目 錄第十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(genomic

7、 DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見第22章） 第二十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建若將外源基因連接到復(fù)制子(基因載體)上,外源DNA就可以作為復(fù)制子的一部分在受體細胞內(nèi)復(fù)制.在基因克隆中基因載體的選擇與構(gòu)建是一項技術(shù)性很強的工作,直接影響到基因克隆的成敗.第二十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接第

8、二十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌K-12改造）限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 感染（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌第二十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等第二十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA

9、目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目 錄第二十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與核轉(zhuǎn)移技術(shù)第二十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。 轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal)目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)第二十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)基因生物是指用實驗方法導(dǎo)入的外源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整和

10、并能遺傳給后代的一類動物。自從1982年P(guān)almiter等首次將大鼠生長激素基因?qū)诵∈笫芫研坌栽酥?，獲得了個體比對照組大一倍的轉(zhuǎn)基因“超級小鼠”以來，這項高新技術(shù)受到各國重視，發(fā)展迅速，取得不少突破，全世界已申請的工程動物專利達到80多項。第二十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因動物是動物整體水平研究目的基因的生物技術(shù)，特點是“分子及其細胞水平的操作，組織及動物整體水平表達”第三十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建過程轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細胞或者胚胎干細胞將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細胞植入假孕小鼠子宮中對轉(zhuǎn)基因動物進行鑒定第三十一張，

11、PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法DNA顯微注射法克隆法胚胎干細胞技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移精子載體法等各有優(yōu)點和缺點，常用的是顯微注射和克隆法第三十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)基因動物的鑒定Southern雜交 確定外源基因的整合以及整合的拷貝數(shù)RT-PCR 確定外源基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄水平Western雜交 確定外源基因蛋白質(zhì)的表達情況實時PCR（熒光定量PCR）第三十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用（1）建立致病基因表達、調(diào)控的動物模型（2）動植物新品種的培育（3）各種基因工程產(chǎn)品的制備（4）探討生殖細胞的基因治療方法

12、第三十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 囊性纖維變性是一種遺傳病，患者體內(nèi)會產(chǎn)生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的內(nèi)部通道，大約有一半的患者活不過31歲。英國PPT公司培育了植入人體基因的克隆羊，羊奶中含有能夠治療囊性纖維變性的人體蛋白。 維爾莫特所在的研究所曾向德國一家藥廠出售一頭這樣的轉(zhuǎn)基因羊，獲得50萬英鎊。第三十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。這樣的個體所攜帶的性狀僅來自一個父親或母親個體,為無性繁殖.1996年,克隆羊”多莉”的產(chǎn)生成為當(dāng)

13、年分子生物學(xué)發(fā)展最重要的事件二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)第三十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 克隆羊“多利”第三十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月基因剔除技術(shù)也稱基因靶向(gene targeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。第三節(jié)、基因剔除技術(shù)第三十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因剔除程序?qū)缁畹幕蚍湃肱咛ジ杉毎?ES細胞),使這一滅活的基因通過同源重組取代原有目的基因,篩選到基因定點滅活的細胞后,通過顯微注射到小鼠囊胚.細胞在小鼠囊胚參與胚胎的發(fā)育,最終形成嵌合體小鼠,由于一部分生殖細胞來源于

14、ES細胞,通過小鼠培養(yǎng)可獲得純合子基因剔除小鼠.第四十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動物疾病可遺傳的模型,探討疾病發(fā)生機制 單基因決定疾病模型 進行基因剔除以模擬基因失活.單基因疾病模型:地中海貧血,動脈硬化,老年癡呆等 多基因決定疾病模型 多基因疾病模型:腫瘤,高血壓,糖尿病第四十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 第四節(jié) 基因沉默技術(shù)第四十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月基因沉默技術(shù)反義(antisen)技術(shù)RNA干涉(RNA Interference,RNAi)第四十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月反

15、義技術(shù)反義RNA是根據(jù)RNA序列合成的互補RNA,可分為三類:作用于核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA形成雙鏈;作用于非編碼區(qū);作用于啟動子反義DNA在DNA或RNA水平上以至轉(zhuǎn)錄與翻譯,其穩(wěn)定性好,有廣泛藥用價值核酶是具有酶活性的RNA,參與RNA加工與成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表達第四十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA干涉(RNAi)RNA干涉技術(shù)是利用體外合成的短雙鏈RNA(21-23nt) 抑制細胞內(nèi)特定基因表達的技術(shù),是轉(zhuǎn)錄后基因失活的一種研究基因功能的有力工具機制:第四十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNAi技術(shù)DicerRNAi技術(shù)第四十六張

16、，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月siRNA5353第四十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRP第四十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Effector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activation第四十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNAi技術(shù)第五十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)課程作業(yè)根據(jù)自身專業(yè)和研究方向，以RNAi技術(shù)在XXX領(lǐng)域的研究進展為題目，寫一篇小綜述。寫作要

17、求：1. 按照一般發(fā)表文獻的格式書寫。2. 可查閱CNKI（中國知網(wǎng)）或Pubmed上相關(guān)文獻，不得抄襲！3. 字?jǐn)?shù)：3000字左右。4. 不得抄襲！第五十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月論文格式題目摘要（Abstract) 200字以內(nèi)正文前言正文問題與展望參考文獻 10-15篇第五十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月完成方式：手寫稿或電子打印稿完成日期：2012年12月15日前交到醫(yī)學(xué)實驗樓B-312或者下周上課課堂上交。第五十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease

18、 Relative Genes第 五 節(jié)第五十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate gene approaches )第五十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月定義 從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用 生化機制已明確、基因

19、表達產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。第五十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月克隆方式 利用特異性抗體篩選表達型cDNA文庫； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。第五十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆第五十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月基因定位的基本方法1.體細胞雜交法 p2832.原位雜交和熒光原位雜交

20、3.連鎖分析第五十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月體細胞雜交:細胞雜交又稱細胞融合,是將來源不同的兩種細胞融合成一個新細胞(雜種細胞).大多數(shù)細胞雜交是用人的細胞與小鼠的體細胞雜交,它的特點是在其繁殖傳代過程中保留小鼠染色體而人染色體逐漸丟失僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的細胞正是進行基因連鎖分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色體上,就可找到某一基因座位第六十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月原位雜交和熒光原位雜交(FISH):根據(jù)疾病基因所編碼蛋白質(zhì)的信息,將其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為探針從基因組DNA中釣取該蛋白質(zhì)量的編碼基因如:用及珠蛋白基因的cDNA作探針,與各種不同的人/鼠雜種細胞進行原位雜交,找出cDNA探針與人染色體DNA的同源互補關(guān)系,從而將及珠蛋白基因分別定位于第16號和第11號染色體上.第六十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月連鎖分析原理:基因在染色體上成直線