細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇

1、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇上海日泰生物部2012年11月1細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇的必要性1.細(xì)胞凍存 細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比優(yōu)勢在于：一，可以減少力、經(jīng)費(fèi)投入，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化；二，有利于保存那些不立即使用的細(xì)胞系或者將細(xì)胞系轉(zhuǎn)給其他使用者。22.細(xì)胞復(fù)蘇 在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時再復(fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。3細(xì)胞凍存復(fù)蘇的原理為使細(xì)胞復(fù)蘇時存活率最高最佳的凍存條件： 盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形成，減小細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細(xì)胞造成的損傷。A) 緩慢冷凍B) 用親水的低溫保護(hù)劑排除水分C)在盡可能低的溫度保存細(xì)胞D)快速復(fù)蘇4細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇關(guān)鍵

2、因素 要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。 5冷凍速率：慢凍復(fù)蘇速率：快融冷凍保護(hù)劑：515甘油或二甲基亞砜（DMSO） 冷凍保存溫度：196 （液氮）6對大多數(shù)有核哺乳類動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活性好的凍存物。 目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑。一般是一些小分子的物質(zhì)，可以滲透到細(xì)胞內(nèi)。非滲透性冷凍保護(hù)劑。一般是些大分子物質(zhì)，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)。 冷凍保護(hù)劑的重要性7冷凍保護(hù)劑的重要性 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高

3、，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，冰晶導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。 在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，在緩慢凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)冰晶減少，從而減少對細(xì)胞的損傷。 8凍存的原則：慢凍凍存液配制試劑名稱組份百分比199/DMEM70%FBS20%DMSO10%9凍存的原則：慢凍細(xì)胞懸液制備1）取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（2106 5 106細(xì)胞/ml)2）加入1.5ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱、批號、代次和冷凍日

4、期，并做好登記。10凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時， 12 /min（4 冰箱存放30min） 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時， 510 /min（ -20 冰箱存放1.5-2h ） 當(dāng)溫度達(dá)-80時，可迅速放入液氮中（ -80 冰箱存放4-12h） 轉(zhuǎn)入液氮罐，注意登記！ 簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐內(nèi)液體上方，30分鐘后，立即投人液氮中。凍存的原則：慢凍11復(fù)蘇的原則：快融復(fù)蘇方法 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇以快速融化為原則。盡快度過冰晶期 復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時造成的細(xì)胞損傷非?？?，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。 12復(fù)蘇的原則：快融復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水