噬菌體展示技術

1、關于噬菌體展示技術第一張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是噬菌體展示 是一項篩選技術，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。表型基因型展示肽編碼基因使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定簡介第二張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Landmarks of phage display 1985 第一次發(fā)表噬菌體展示技術；展示多肽Smith GP. Science.1985; 228:1315-71988 噬菌質粒系統(tǒng)1990 抗

2、體片段的展示1993 展示cDNA文庫1994/1995 研發(fā)了phage two-hybrid技術1996 首次體內(nèi)in vivo 淘選試驗1998 噬菌體展示載體作為基因導入載體1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selectionKilling cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology 2008

3、, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37第三張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月展示系統(tǒng)Display SystemCell Based1、Phage Display2、Cell Surface DisplayCell Free 1、Ribosome Display2、mRNA Display第四張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體展示系統(tǒng)的分類 根據(jù)噬菌體不同Phage M13, f1, fdT7, T4, lamda根據(jù)載體不同Vector True Phage Phagemid根據(jù)文庫不同Library 隨機肽庫、cDNA文庫、抗體文庫、蛋白質文庫

4、第五張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月M13噬菌體的組成和結構絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407 bp?；蚪M編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白質。與展示密切相關的有兩種結構蛋白質。DNA在細菌內(nèi)滾環(huán)復制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒第六張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Life Cycle of M13 pIII蛋白結合于E.Coli 的F纖毛;病毒ssDNA進入細菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37）。感染后1小時

5、內(nèi)平均每個細胞分泌1000個噬菌體。第七張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月次要衣殼蛋白pIII406 aa 組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區(qū)組成：N1 穿膜區(qū)：作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關。N2 受體結合區(qū)：負責結合F菌毛。CT 疏水區(qū)：組裝前黏附在細菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性。第八張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月主要衣殼蛋白pVIII每個病毒子含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達的多肽是低價的，而以pVIII融合子方式表

6、達的多肽則是高價的（每個病毒子200個拷貝）。這種高價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫都是pIII融合方式（每個病毒子展示5個拷貝的外源多肽）。第九張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同? pVIII 展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300 aa的多肽。噬菌質粒能展示的蛋白已經(jīng)達到86 kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個病毒子含個拷貝的pIII

7、蛋白，這五個蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。第十張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體質粒方便克隆、增強遺傳穩(wěn)定性噬菌體質粒特征： 攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒有其他噬菌體基因。有質粒復制起點(322 ori)和噬菌體復制起點(f1 ori用于合成ssDNA)。有包裝序列信號（packing signal）。有供篩選的抗生素標記基因。Helper phage：提供噬菌體質粒復制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1 oridefect)。第十一張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體展示技術流程 淘選的方法親和淘選 直接包被法淘選法

8、：優(yōu)點：簡單直接。缺點：偶爾會導致配體結合位點難以進入 可能是由于分子的立體封阻 或者是靶分子表面的部分變性而引起液相法：先將噬菌體庫在液相中與靶分子進行預結合，然后將噬菌體-靶分子復合物親和捕獲于親和介質上，如：鏈霉親和素包被的表面。建庫：例子含編碼12肽DNA序列為5CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC T(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、G四種堿基，K代表G、T兩種堿基，(NNK)12為編碼隨機12肽部分，劃線部分含有Bgl識別序列。擴增-嵌合-噬菌體擴增第十二張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月親和淘選噬菌體肽

9、庫與靶分子相互作用洗滌去未結合的或非特異性結合的噬菌體將特異性結合的噬菌體洗脫下來三輪淘選后，克隆測序第十三張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體展示的應用 抗原表位分析制備特異性抗體制備疫苗、多價疫苗構建新型的生物催化劑如Renet al (1997)將T4 DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復合體?；蛘甙殉砂偕锨€酶分子的活性位點展示到同一個噬菌體顆粒上，制造superenzyme。篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫中篩選到非競爭性地抑制F VIIa 活

10、性的肽段。第十四張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體展示的應用 蛋白質蛋白質相互作用噬菌體cDNA文庫與芯片相結合(a)合成噬菌體cDNA文庫。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準備。第十五張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體展示的應用應用舉例用病人IgE血清對6種不同的cDNA文庫淘選，5輪后，挑出38,000個克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知，186種是新的過敏源。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢(小麥黑霉病菌) Cladosporium herbarum

11、雞腿蘑（Coprinus comatus）皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)花生和人肺組織Crameri, R. et al. (2001) Tapping allergen repertoires by advanced cloning technologies. Int. Arch. Allergy Immunol.124, 4347第十六張，PPT共十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體表面展示肽庫優(yōu)缺點優(yōu)點：M13無需體外包裝電轉化效率高, 庫容量大2.8 109 M13噬菌體純化步驟簡單，可加速淘選進程可避免細胞蛋白的污染Any ligand(natural or synthetic) 隨機肽庫體內(nèi)篩選器官特異性多肽缺