齊魯醫(yī)學胃潰瘍模型

1、精品醫(yī)學文檔 精品醫(yī)學文檔 精品醫(yī)學文檔 胃潰瘍實驗模型探索1 病因病機消化性潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)慢性病。中醫(yī)學屬“胃脘痛”范疇。胃脘痛又稱胃痛，臨床表現(xiàn)以胃脘部經(jīng)常疼痛為主癥，痛時連及脅背，或兼見惡心、嘔吐、吞酸、嘈雜，大便溏薄或秘結，甚至吐血、便血等癥【1】。胃、十二指腸潰瘍的病因和發(fā)病機理較為復雜，迄今尚未完全闡明。目前認為胃、十二指腸是一種多病因疾病，各種與發(fā)病有關的因素如胃酸、胃蛋白酶、感染、遺傳、環(huán)境、飲食、生活習慣、神經(jīng)精神因素等均可誘發(fā)潰瘍產(chǎn)生。而胃酸-胃蛋白酶的侵襲作用增強和胃粘膜防護機制的削弱是本病發(fā)生的基本原理，任何影響這兩者平衡關系的因素，都可能是本病發(fā)病及復發(fā)的原

2、因。其次幽門螺桿菌的感染可引發(fā)胃內(nèi)多種炎性介質(zhì)的釋放，這些炎性介質(zhì)可致胃黏膜的損傷。胃、十二指腸潰瘍在中醫(yī)學屬于胃痛、胃脘痛、心痛等范疇。中醫(yī)認為該病的發(fā)生主要由于情志失調(diào)，傷肝犯胃；飲食不節(jié)或勞倦過度，脾胃虛寒；外感寒邪，內(nèi)客于胃等導致胃失和降、氣機不利、胃失濡養(yǎng)而發(fā)生胃脘痛。胃脘痛的發(fā)生，其病變臟腑主要在胃，但與肝脾關系密切，膽腎也與之相關。若久病人絡，瘀血阻滯胃絡，絡脈損傷，則會出現(xiàn)吐血、便血等癥。潰瘍模型的種類與方法幽門結扎型潰瘍、應激性潰瘍（水浸法）、胃粘膜損傷性潰瘍（醋酸法）、藥物誘發(fā)型潰瘍。四種潰瘍動物模型總的特點是：結扎法潰瘍?yōu)閳A形、橢圓形、線性，結扎后隨時間延長，潰瘍數(shù)目增加

3、，潰瘍恒定發(fā)生在前胃部，深達肌層。應激法潰瘍數(shù)量多，水溫超過24潰瘍出現(xiàn)少而輕，水浸8h以上開始出現(xiàn)潰瘍，隨時間延長潰瘍數(shù)量增加，潰瘍均發(fā)生在腺胃部，潰瘍淺表，均不累及粘膜肌層。醋酸法潰瘍發(fā)生在注射部位，潰瘍部位胃壁增厚，潰瘍數(shù)與注射醋酸部位準確與否有關，病理組織學改變與人類慢性潰瘍近似。藥物誘發(fā)性潰瘍發(fā)生在腺胃部，潰瘍數(shù)量少，體積小而淺表，僅累積粘膜上皮表層，部分深達粘膜腺體，但不超過粘膜肌層。2.1應激性潰瘍模型2.1.1 應激性潰瘍原理應激性潰瘍發(fā)生機制有復雜的神經(jīng)一體液因素參與，應激性胃潰瘍是先使皮層中樞的興奮和抑制過程失調(diào)，進而引起植物神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂，導致迷走神經(jīng)張力過高，致使胃肌

4、強力收縮，壓迫肌肉血管，引起繼發(fā)性黏膜血管運動障礙，導致潰瘍形成。人類由于嚴重創(chuàng)傷、燒傷等可產(chǎn)生急性應激性潰瘍，精神過度緊張，強烈的情緒激動導致潰瘍的發(fā)生或復發(fā)。與中醫(yī)肝郁型自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有一定的聯(lián)系。 2.1.2 應激性潰瘍方法 選取體重在160180g健康大鼠，禁食自由飲水48h后，將大鼠頭向上束縛于老鼠固定器，以不能自由活動為度。隨即將動物頭部向上垂直浸泡在溫度相對恒定(水溫一般20左右)的冷水中，水平面在大鼠劍突部位，20h后取出，用頸椎脫位法處死動物，剖腹將胃取出，結扎賁門、幽門，從腺胃部注入1 甲醛10mL于胃中，并將全胃放入1 甲醛溶液浸泡10 min，沿胃大彎將胃剪開，用

5、自來水輕輕沖洗胃黏膜面，用棉簽拭去腺胃部血絲，然后展開腺胃部，肉眼或放大鏡觀察腺胃部黏膜損傷程度。潰瘍位于腺胃部，表現(xiàn)為點狀出血，并出現(xiàn)線狀或直徑為l-2mm圓形表淺性潰瘍，潰瘍的程度以潰瘍指數(shù)表示，并計算潰瘍的發(fā)生率。潰瘍發(fā)生率：潰瘍發(fā)生的動物數(shù)占試驗動物數(shù)的百分比。2.1.3應激潰瘍模型評價指標（以下指標對胃潰瘍模型均適用） 圖像積分法量化潰瘍面積【5-6】：造模成功取胃后，沿胃大彎剪開，將胃壁展平，用數(shù)碼相機將胃壁拍下，拍攝距離為10 cm用 photoshop60軟件處理圖片，分辨率為72像素英寸，每張圖片設置為20 cm15 cm(實物等比圖片為4 cm3 cm)，RGB格式，加網(wǎng)格

6、線(視圖顯示網(wǎng)格)，然后對潰瘍所占的格數(shù)進行積分。占一格者或大于等于12格記為1分，小于12格者記為05分，總計后作為積分同樣對胃總面積進行積分，將潰瘍面積的積分與胃總面積的積分的比值代表潰瘍面積比。全胃的潰瘍面積比為該鼠的潰瘍指數(shù),根據(jù)潰瘍指數(shù)進一步計算潰瘍抑制百分率：潰瘍抑制率百分率=(對照組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/對照組潰瘍指數(shù)100%。圖像積分法是統(tǒng)計潰瘍面積胃總面積的比值，可以消除胃面積大小不均造成的誤差，使統(tǒng)計結果更精確，量化 并且，這種方法簡單方便， 圖像積分法是利用大眾性的photoshop軟件處理圖像，實驗室能達到此方法所需的條件及技術要求。 胃黏膜NOS測定【8-9】：

7、內(nèi)源性一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種重要的氣體信使分子，在胃腸道各種生理及病理活動過程中起重要作用。NO血管內(nèi)皮舒張因子能改善胃黏膜的微循環(huán)血流量，維持和加強胃黏膜屏障，抑制胃腸運動及調(diào)節(jié)胃酸分泌，從而有效地保護胃黏膜。NOS是NO合成過程中的關鍵酶，在應激狀態(tài)下，大鼠胃黏膜氧自由基不斷蓄積，并發(fā)生微循環(huán)障礙導致胃黏膜損傷，而NO的產(chǎn)生即可減輕胃黏膜的損傷以阻礙胃潰瘍的發(fā)生與發(fā)展?？?jié)兯幬飳ξ葛つOS的產(chǎn)生皆具有一定的調(diào)節(jié)作用，使其增加并維持在一個較高的水平，起到保護胃黏膜的效果，因此NOS的測定在抗?jié)兯幬镅芯恐杏幸欢ㄖ笇б饬x。按南京建成生物工程研究所提供的說明書進行操

8、作。即：取大鼠胃黏膜組織01 g加9倍的生理鹽水09 mL制備成10的組織勻漿，3000 rmin，離心10 min，取上清50 L測NOS活力，另取50 L測蛋白含量。將測量值代人下述公式得出總NOS活力值。總NOS活力=總NOS測定管A值空白管A值呈色物納摩爾消光系數(shù)反應液總積取樣量1比色光徑反應時間蛋白含量脾指數(shù)的測定【8】：麻醉處死后取脾稱重，脾指數(shù)()=脾臟質(zhì)量體質(zhì)量X 100 。2.1.4 注意事項（1）動物體重大小應基本一致，籠底不能積留糞便，一面動物自食。（2）潰瘍程度與應激強度密切相關，包括應激時間、水溫、水浸部位的高度因素，應嚴格控制，以免影響實驗結果。（3）注意應激時捆綁

9、動物的松緊度，避免動物溺水死亡或來回移動影響水浸部位高度。（4）雌性大鼠性烈，較易形成潰瘍，實驗時注意選用雌鼠。 （5）實驗過程中動物需單籠飼養(yǎng)。2.1.5 預實驗結論 在應激實驗摸索中，結合實驗室條件，做應激胃潰瘍模型應選用雌性體重160180g健康大鼠為宜，應激過程中控制水溫在230.5，大鼠浸泡20h后取出，在該條件下做應急胃潰瘍實驗，較易成功造模，重復性好，且模型肉眼可見潰瘍較明顯。2.2 幽門結扎型潰瘍2.2 .1 幽門結扎型潰瘍原理結扎大鼠幽門造成胃液在胃中滯留，致潰瘍因素增強，胃壁防御能力減弱，導致潰瘍形成。2.2 .2 幽門結扎型潰瘍方法 選取體重在180200g健康大鼠，禁食

10、自由飲水72h后，用水合氯醛麻醉,打開腹腔,用縫合線結扎幽門十二指腸結合部。結扎時小心避開血管，縫合腹壁。術后18 h結扎賁門取出全胃，將胃浸入1%甲醛溶液中, 10 min后,在胃大彎處剪一小口收集胃液。然后沿胃大彎將胃剪開，用自來水輕輕沖洗胃黏膜面，將胃平鋪于白紙上，觀察潰瘍發(fā)生情況。2.2.3 幽門結扎型潰瘍評價 pH值的測定:把取出的胃體沿胃大彎剪一小口,將胃液傾倒于刻度離心管中,用精密pH試紙測胃液的pH值,記錄。 胃液量的測定:將上述胃液以3000r/min的速度離心10min后,用10ml注射器抽取離心管中的上清液,記錄胃液總量,將胃液注入試管中。 胃酸的測定：將清晰胃液各取1m

11、l分別置于小燒杯中，加入酚紅指示劑2滴，用滴定管用0.01mol/LNaOH滴定直至溶液變紅不退為止，即為胃酸的總酸度（mmol/L）。 胃蛋白酶的測定：采用麥特氏毛細玻管測定法。將內(nèi)徑12mm粗細均勻的毛細玻管裁成10cm長，洗凈烤干待用。用雞蛋一個，取其蛋清充分打勻后用濾布過濾，將備用毛細玻管利用虹吸作用，灌滿蛋清（注意管內(nèi)無氣泡）。然后放在85熱水中使蛋白凝固，貯冰箱中備用。試驗時取胃液1ml放入50ml的三角燒瓶中，加0.05mol/L鹽酸溶液15ml搖勻，放進蛋白管二根。塞好瓶口，在37恒溫孵育24h，取出蛋白管，用尺測量蛋白管兩端透明部分的長度(mm),以四端之值求其平均值。胃蛋白

12、酶活性單位=平均值216；胃蛋白酶排出量（活性單位/h）=胃蛋白酶活性單位每小時胃液量。2.2.4 注意事項（1）動物要嚴格禁食72h,以使胃內(nèi)完全排空，否則食物殘渣會影響胃分泌。（2）手術幽門結扎時，須小心避開血管，否則因胃腸血液循環(huán)受阻而影響胃分泌。勿用器械鉗夾胃壁，因器械對胃的刺激處，易形成潰瘍，干擾試驗。（3）實驗過程中動物需單籠飼養(yǎng)。參考文獻：1 王國慶，淺談胃脘痛的辯證與治療J.中醫(yī)研究，2009,22（6）：53-54.2 劉良，王建華，邵庭蔭等，大鼠束縛水浸應激性胃潰瘍模型的實驗控制J.中國藥理學通報,1988,4(4):246-248.3 邢建峰，董亞琳，王秉文等，沙棘果肉油

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