流式細胞術及其科研應用

1、流式細胞術及其科研應用流式細胞儀的原理流式細胞術的基本概念流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量流式細胞術的特點極短時間內(nèi)可分析大量細胞，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀（Flow cytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。 可同時分析單個細胞的多種特征，當同時用多種分子探針，如用不同熒

2、光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，即可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數(shù)更為準確。定性或定量分析細胞：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、Ca2+濃度、酶活性以及細胞的功能等均可進行單細胞水平的定性與定量分析 強大的分選功能，在分析的同時可以對特定群體加以分選流式細胞儀的檢測范圍細胞結構細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結合位點細胞受體當前流式細胞分析發(fā)展趨勢從相對細胞計數(shù)到絕對細胞計數(shù) 從相對定量到絕對定量分析從單色到多

3、色熒光分析 從細胞膜成分到細胞內(nèi)成分分析從細胞分析到可溶性成分的流式細胞分析 散射光信號Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細胞粒度及細胞內(nèi)相對復雜性LaserFALS Sensor外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）流式細胞儀的檢測信號熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做

4、多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號雙色直接染色數(shù)據(jù)分析直方圖分析數(shù)據(jù)分析點圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析數(shù)據(jù)分析三維圖分析流式細胞儀的應用臨床研究: 血液、腫瘤、藥理、免疫.生物學研究：遺傳、生殖、微生物、細胞生物、毒理、分子生物、.環(huán)境研究：海洋生態(tài)研究.制藥工業(yè)食品工業(yè)農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)流式細胞儀的應用領域流式細胞儀的臨床應用(免疫)淋巴細胞免疫分型淋巴細胞亞群分析CD4絕對計數(shù)HIV的診斷與研究淋巴細胞 CD4/CD8分析CD4絕對計數(shù)T細胞活化細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細胞和單核細胞的活化檢測細胞因子的檢測HLA-B27檢測流式細胞儀的

5、臨床應用(血液)白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細胞計數(shù)PNH診斷網(wǎng)織紅細胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達血小板活化網(wǎng)織血小板分析流式細胞儀的臨床應用(腫瘤)細胞周期分析DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要標志在L&L病理形態(tài)學不能做出診斷前可提供確切診斷信息DNA非整倍體的交界瘤應按惡性對待形態(tài)學表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標多藥耐藥基因的檢測流式細胞儀的科研應用樹突細胞研究干細胞研究細胞凋亡細胞動力學功能研究環(huán)境微生物分析流式細胞術與分子生物學研究淋巴細胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（

6、CD19+），與體液免疫有關T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫有關總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能， 能夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。淋巴細胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達，T淋巴細胞又分為T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+）T抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評價那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L濕性關節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性

7、腫瘤、再生障礙性貧血常見疾病的T 淋巴細胞的變化：疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類風濕性關節(jié)炎 （活動期） 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 - 或 （活動期） 多發(fā)性硬化癥 重癥肌無力 膜型腎小球腎炎 胰島素依賴性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性貧血 上呼吸道感染 常見疾病的T 淋巴細胞的變化 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤 再障及粒細胞減少癥 巨細胞病毒感染 血小板減少 活動性特應性皮炎 過敏性皮炎 淋巴細胞亞群雙色分析12%76%49%26%11%AIDS 病人T亞群分析27-51%15-44%50-84%先天性無 r 球蛋白血癥5-18%淋巴細胞活化功能研究T淋巴細胞

8、活化細胞數(shù)目增殖細胞表面表達活化標記分泌細胞因子T細胞激活抗原表達的動力學曲線活化的淋巴細胞分泌細胞因子FastImmune Assay System快速全面檢測淋巴細胞功能 BD FastImmune Activation System快速免疫活化檢測系統(tǒng)lymphocyte Activation 4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus優(yōu)點快速全程5h簡便全血分析（肝素鈉抗凝血）無需分離PBMCs無需組織培養(yǎng)免洗試劑，無需洗滌離心高效多參數(shù)分析加速研究進程功能活性檢測同時報告單個細胞亞型可外延T細胞分析可進行亞群分析可外延

9、于B、NK、單核細胞接近生物體自身分析條件應用全血保留了細胞與生化微環(huán)境更能代表體內(nèi)狀態(tài)BD FastImmune Activation System快速免疫活化檢測系統(tǒng)應用實例：HIV病例T細胞活化檢測BD FastImmune Cytokine System快速免疫細胞因子檢測系統(tǒng) AntiIFNgCD69 Activation 37 IncubationIntracellular StainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurface StainWashcytokineWashWashprotein

10、blocking基于細胞水平的研究胞內(nèi)因子胞外因子優(yōu)點快速一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時簡便全血分析（肝素鈉抗凝血）無需分離PBMCs無需組織培養(yǎng)高效可在同一個細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞亞型，進行多參數(shù)相關分析接近生物體自身分析條件應用全血保留了細胞與生化微環(huán)境更能代表體內(nèi)狀態(tài)注意 質(zhì)控：用CD69做刺激和破膜效果的判定BD FastImmune Cytokine System快速免疫細胞因子檢測系統(tǒng)應用實例：分析1型與2型免疫反應Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白定量技術導言常規(guī)的蛋白分析方法：ELIS

11、A：一次反應只能檢測一個指標Western blot：不能對蛋白精確定量不足之處：檢測多個指標需耗費大量樣本分批操作導致組間差異大操作繁瑣，耗時耗力如何能夠從單個微量樣本中一次檢測多個目標蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？針對于此，BD-Pharmingen成功研發(fā)了基于流式細胞儀檢測平臺的液相多重蛋白定量技術BD Cytometric Bead Array，簡稱CBA CBA技術簡介CBA是一系列帶有不同強度紅色熒光、包被有捕獲抗體的微球，類似ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細胞培養(yǎng)上清液等）中相應的抗原，再結合PE標記檢測抗體，形成雙抗體夾心結構，通過流式細胞儀

12、進行熒光檢測，便可同時對樣本中的多種可溶性蛋白成分進行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBeadBD Cytometric Bead Array123不同強度紅色熒光的捕獲微球，在FCM FL3檢測不同的目標蛋白PE 標記的檢測抗體，在FCM FL2檢測。 PE的熒光強度即反映靶蛋白的含量456Human Th1/Th2 Lymphokine CBAHuman Th1/Th2 Lymphokine CBATh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IF

13、N用 FL3熒光的強度不同區(qū)別 種不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2 (PE) detector reagent樣本處理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithmResult reporting incl

14、uded in softwareHuman Th1/Th2 Lymphokine CBAHuman Th1/Th2 Cytokine CBA KitNo sample added inDetector antibodies only Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 10 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard20 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard40

15、pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard80 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard156 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard312 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard625 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assa

16、y Standard1250 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard2500 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay StandardHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA 標準曲線5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-操作步驟檢測物與捕獲微球共孵育

17、。洗滌。標記熒光探測試劑（FITC或PE標記）。洗滌。流式細胞儀上機檢測。CBA分析軟件批量數(shù)據(jù)分析。CBA 分析軟件Home ScreenToolbarCalibration entry screen與傳統(tǒng)的ELISAs檢測相比能夠同時對單一樣本進行多種目的蛋白檢測較傳統(tǒng)檢測節(jié)省樣本量（50l）與ELISAs相比靈敏度高（2.8pg/ml）、重復性好檢測的線性范圍寬（0-5000pg/ml）所有分析只需一組標準曲線避免酶聯(lián)反應所致人工假象強大的CBA分析軟件節(jié)省操作時間、檢測時間和分析時間Human Allergy Mediator Kit使用Prostate-specific antige

18、n（PSA-3）及其突變體PSA-3A對前列腺癌患者T細胞免疫，通過Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit檢測免疫T細胞的細胞因子分泌水平A，B，C為稀釋標準，D為無處理對照組，E為PSA-3A處理組，F(xiàn)為PSA-3處理組摘自Terasawa H, et al. Clinical Cancer Research.Vol.8,41-53, January 2002上述研究發(fā)現(xiàn)PSA-3A比PSA-3能更有效的殺傷前列腺腫瘤，與PSA-3A能刺激T細胞分泌更高水平的IL-2、IL-4、IL-5和IFN-有關，為后續(xù)藥物開發(fā)打下基礎CBA新產(chǎn)品系列CBA Flex Set基本原

19、理與CBA Kit相似，略有不同檢測原理：Flex Set微球帶有近紅外和紅色兩種熒光，分別在流式細胞儀的FL3（近紅外熒光）和FL4（紅色熒光）通道檢測，通過這個二維矩陣（對應于微球上的特定序號）識別捕獲微球，從而鑒定目的蛋白，PE標記的檢測抗體在FL2通道來對目的蛋白定量newCBA Flex Set的分析軟件 FCAP Array SoftwareCBA Kit與CBA Flex SetCBA Kit同時檢測5、6或者7個全部試劑CBA Analysis Software檢測指標組合固定CBA Flex Set最多達75個需另購Buffer kitFCAP Array Software檢

20、測指標可自由組合CBA/CBA Flex set的應用領域血清、血漿、眼淚、房水、唾液、體腔灌洗液、細胞培養(yǎng)液上清、細胞裂解物等各種液相樣本中可溶性細胞因子、炎癥因子、趨化因子、酶等的濃度檢測細胞信號傳導中磷酸化蛋白、凋亡相關蛋白定量分析 免疫疾病或傳染疾?。ㄈ缪鄄考膊?、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、新生兒溶血癥及膿血癥、病毒性感染等）的輔助診斷和監(jiān)控腫瘤研究藥效評價，藥物研發(fā)、疫苗研究總體免疫功能分析現(xiàn)有CBA Kit產(chǎn)品Human Allergy Mediator KitIL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, GM-CSFHuman Allergy Mediator

21、 Kit IIIL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSF, EotaxinHuman Anaphylatoxin KitC4a, C3a, C5aHuman Angiogenesis KitIL-8, bFGF, Angiogenin, VEGF, TNFHuman Chemokine KitIL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10Human Chemokine Kit IIIL-8, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1Human Inflammation KitIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70

22、Human Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-gHuman Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation KitIL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNFNon-human Primate Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL

23、-6,TNF, IFN-gHuman Apoptosis KitCleaved PARP, Bcl-2, Active Caspase-3Mouse Immunoglobulin Isotyping KitHeavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgEHuman Inflammation Lyophilized StandardsIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized Stan

24、dardsIL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation Lyophilized StandardsIL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF信號傳導類細胞因子類磷酸化蛋白人 小鼠 大鼠ERK (T202/Y204) JNK (T183/Y185)p38/MAPK (T180/Y182)PLC-gamma (Y783)ZAP70 (Y319)S

25、yk (Y352)Stat1 (Y701)Btk (Y551)RSK (T573)Itk (Y511)eNos (S1177)ZAP70（Y319）Total SykTotal Stat1IFN-IL-2IL-4IL-5IL-6IL-8IL-10IL-1IP-10IL-12p70LT-MIGMCP-1MIP-1 TNFIFN- IL-2IL-4TNFIL-10IL-6IL-5IL-12p70 IFN- IL-4TNFIL-10IL-6 現(xiàn)有CBA Flex Set產(chǎn)品樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）DC的分化和成熟DC可分為前體DC，未成熟DC，成熟DCDC起源于骨髓CD34+

26、多能細胞，在GM-CSF作用下，進一步分化為DC前體細胞，包括髓系前體和淋巴系前體，并離開骨髓進入外周血。在外周血中至少有兩種DC前體被鑒定出來： Plasmacytoid DCPDC漿細胞樣的樹突細胞 Myeloid DCMDC髓樣的樹突細胞血液中的前體DC隨血液遷移到皮膚、胃腸道、心、肝、肺等非淋巴器官發(fā)育為未成熟DC未成熟DC攝取外來抗原后，可自發(fā)成熟，由外周向次級淋巴器官歸巢在成熟過程中，DC攝取和加工處理外來抗原的能力逐漸減弱，而遞呈抗原的功能逐漸增強A review of Jacques Banchereau樹突狀細胞的可塑性DC在不同細胞因子和生長因子的作用下可以向著不同的方向分

27、化 DC分化過程中的不同刺激引導它們向多種組織和器官移動，在這些組織中擔當起對抗入侵感染因素的哨兵DC的表面標志人DC的主要特征性表面標志為CD1a和CD83，CD83還是DC充分成熟的標志。成熟DC高表達CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表達或低表達這些分子未成熟DC具有強大的內(nèi)吞作用，并高表達大多數(shù)趨化因子受體所有DC共同的突出特點是能高水平表達MHC-II類分子如HLA-DR，DC成熟過程突出的標志是MHC-II類分子的重分布，從主要在細胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕诩毎け砻妗?人外周血DC亞群的鑒定PDC：linnegCD11cnegCD123high

28、；MDC：linnegCD11chighCD123low 二者還都高表達MHC-（HLA-DR），但都不表達lin（CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56）注：CD11c：整合素x鏈 CD123：IL-3受體鏈DC體外誘導分化監(jiān)控DC成熟度BD Multicolor MDDC phenotyping reagentCD209 (DC-SIGN)：DC獨有標志CD83：充分成熟標志CD86：DC成熟過程中表達增加小鼠DC小鼠DC的標志是CD11c，成熟DC也有MHC-和CD80，CD86的表達小鼠DC前體主要分為兩類：功能上等同于人MDC和PDC小鼠DC制備：小鼠骨髓BD IM

29、ag Mouse Dendritic Cell Enrichment Set大鼠DC：常用標志OX62，OX6（MHC-），CD80，CD86等細胞凋亡檢測細胞凋亡的分析細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學檢查DNA Ladders實驗流式細胞儀檢查與凋亡相關的病理過程HIV自身免疫性疾病腫瘤細胞凋亡的分析細胞凋亡的主要表現(xiàn)細胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI細胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關蛋白：FasBcl-2細胞凋亡PI分析PI - Fluorescence# Events凋亡細胞正常G0/G1期細胞細胞凋亡Active Caspases-3細胞凋亡Caspases-3細胞凋亡Annexin 細胞凋亡Annexin 凋亡檢測（Annexin V/PI法） PIAnnexin V-FITC凋亡檢測（BrdU法） 細胞凋亡BrdU 流式分選 與分子生物學研究流式分選與分子生物學研究除了