xb四、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)

1、第四章 植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)12所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ) 植物細(xì)胞工程通常采用的技術(shù)手段 植物組織培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞培養(yǎng) 3第一節(jié)植物細(xì)胞工程概述第二節(jié)植物組織與器官培養(yǎng)第三節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)第四節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交4第一節(jié)植物細(xì)胞工程概述一植物細(xì)胞工程的定義二植物細(xì)胞工程的內(nèi)容三存在的理論與生產(chǎn)問題四植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別五植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)內(nèi)容與分類5一、植物細(xì)胞工程（plant cell engineering）的定義：是在植物細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)上，以植物細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按照人們

2、的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)制新種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用產(chǎn)物的過程。6二、 植物細(xì)胞工程的內(nèi)容：A、植物細(xì)胞工程（對象或內(nèi)容） 植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù) 植物細(xì)胞融合技術(shù) 植物細(xì)胞質(zhì)工程技術(shù) 植物染色體工程技術(shù) 轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)B、植物細(xì)胞工程（目的或應(yīng)用） 植物細(xì)胞工程與育種 植物細(xì)胞工程與體外快速繁殖 植物細(xì)胞工程與優(yōu)質(zhì)種質(zhì)體外保存 植物細(xì)胞工程與藥物 食品工業(yè)化生產(chǎn)7三、存在的理論與生產(chǎn)問題 植物細(xì)胞全能性的本質(zhì) 細(xì)胞分化機(jī)制和代謝途徑的調(diào)控理論 培養(yǎng)細(xì)胞中的生理、后成雜種和遺傳的變異問題 體細(xì)胞雜交和有性雜交的比較 不親和性機(jī)制 細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法 細(xì)胞器的分離和引入技術(shù) 原

3、生質(zhì)體誘導(dǎo)融合改進(jìn) 細(xì)胞的培養(yǎng)篩選及鑒定 花粉和花藥培養(yǎng)藥物生產(chǎn)的中間試驗(yàn) 試管苗的大規(guī)模繁殖和生產(chǎn)8四、植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別 形成時間對象培養(yǎng)方式目標(biāo)特點(diǎn)植物組織培養(yǎng)早組織或細(xì)胞模擬體內(nèi)體外培養(yǎng)植物快速繁殖的組織培養(yǎng)技術(shù)無性繁殖植物細(xì)胞培養(yǎng)晚細(xì)胞（不能形成組織）實(shí)驗(yàn)室無菌條件生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物9五、植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)內(nèi)容與分類： 試管苗、人工種子、單倍體誘導(dǎo) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)（植物微繁殖技術(shù)） 原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、 體細(xì)胞變異、種質(zhì)保存 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（植物細(xì)胞大量培養(yǎng)）植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)根據(jù)對象不同，培養(yǎng)方式也可分為： 根據(jù)水平不同： 植株培養(yǎng)（plantlet cul

4、ture） 植物胚胎培養(yǎng)(plant embryo culture) 細(xì)胞類型（體、生殖細(xì)胞） 植物器官培養(yǎng)(plant organ culture) 單倍體、二倍體和多倍體 植物組織培養(yǎng)(plant tissue culture) 離體、人工無菌環(huán)境 愈傷組織培養(yǎng)(callus culture) 原生質(zhì)體培養(yǎng)(plant protoplast culture) 1011第二節(jié)植物組織與器官培養(yǎng)一、植物細(xì)胞的全能性 二、植物組織與器官培養(yǎng)121.定義： 生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能的特性。2. 原理：生物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必

5、需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。3. 差異：植物細(xì)胞全能性動物細(xì)胞全能性在植物細(xì)胞中受精卵生殖細(xì)胞具有分化能力的細(xì)胞成熟的體細(xì)胞一、植物細(xì)胞的全能性13在生物體內(nèi)，細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化為不同的組織、器官，是因?yàn)椋?A、細(xì)胞喪失了全能性 B、基因的表達(dá)有選擇性 C、不同的細(xì)胞內(nèi)基因不完全相同 D、在個體發(fā)育的不同時期，細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生 了變化。14 科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。 全能性表現(xiàn)的條件？15二、植物組織與器

6、官培養(yǎng)再分化脫分化愈傷組織外植體試管苗植株161. 定義： 植物組織與器官培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實(shí)、種子等）、組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。17細(xì)胞離體、一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件2. 必要條件：環(huán)境條件：溫度：252光照：光照強(qiáng)度、光質(zhì)（光波長）、光周期18無機(jī)成分：N，P，K， S，Ca，Mg等大量元素及部分微量元素碳源：2%5%的蔗糖維生素：B族，Vc；0

7、.110mg/L植物生長物質(zhì)：生長素類，細(xì)胞分裂素類有機(jī)附加物：如水解酪蛋白（CH）、酵母提取物（YE）、麥芽提取物（ME）和椰子乳（CM）等營養(yǎng)條件：193. 發(fā)展歷程： 1934年204. 幾個概念 外植體（explantation）：是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。愈傷組織（callus）：是指由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。（細(xì)胞的大小、形狀、液泡化程度、胞質(zhì)含量和細(xì)胞壁特性具很大差異；細(xì)胞水平已分化，但沒有組織、器官水平分化，無組織結(jié)構(gòu)）（去）脫分化（dedifferentiation）：一個已經(jīng)停止分裂的

8、成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的現(xiàn)象。21再分化（redifferentiation）：指原已分化的細(xì)胞過脫分化后再次分化的現(xiàn)象，最終可進(jìn)一步形成完整的小植株。繼代培養(yǎng)（subculture）：是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方式。 胚狀體（embryoid）：是在植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育形成的胚狀結(jié)構(gòu)，其主要特征是有根、芽兩極，和母體植物或外植體的維管組織無直接聯(lián)系。 22235. 植物組織培養(yǎng)基本步驟： 培養(yǎng)材料的采集；培養(yǎng)材料的消毒；制備

9、外植體；接種和培養(yǎng)；根的誘導(dǎo)；組織苗的練苗移栽。 24植物材料的采集和取材25外植體的制備26外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。外植體滅菌消毒（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等）；用消毒過的器械將外植體置于培養(yǎng)皿上；切取所需的外植體；將外植體接種于培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基上。整個試驗(yàn)在超凈工作臺上進(jìn)行，保持無菌！外植體經(jīng)過一段時間在培養(yǎng)基上生長后，會形成愈傷組織。27接種286. 愈傷組織培養(yǎng)的基本過程： 愈傷組織的形成；愈傷組織的生長；愈傷組織的分化和形態(tài)的發(fā)生。 29愈傷組織的形成愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞（細(xì)胞排列疏松、無規(guī)則）。30愈傷組織

10、的形成313233試管苗的形成34試管苗3536培養(yǎng)室37移栽經(jīng)過煉苗的小苗，可以和一般植物一樣進(jìn)行大規(guī)模栽培3839試管苗大規(guī)模培養(yǎng)40實(shí)例：非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)41植物組織培養(yǎng)過程42過程離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細(xì)胞分裂素、生長素再分化植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)條件： 含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的pH、適時光照等。上述過程中細(xì)胞的全能性和營養(yǎng)類型發(fā)生了什么變化？437. 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1）植物離體快繁2）培養(yǎng)無病毒植株（植株脫病毒）3）花藥離體培養(yǎng)（單倍體育種）4）制作“人工種子”5）利用愈傷組織生產(chǎn)植物細(xì)胞產(chǎn)品

11、44人工種子用人工種皮包被體細(xì)胞胚，可以制造人工種子人工種皮：藻酸鈉解決有些植物結(jié)子困難、發(fā)芽率低、繁殖困難等問題45人工種子自然種子胚狀體人工種皮人工胚乳胚種皮胚乳46制作過程體細(xì)胞胚與藻酸鈉混合后，滴入到硝酸鈣或CaCl2中，20分鐘后，表面聚合，形成人工種子47細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)48第三節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)一概述二植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基三植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)四植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用49一、概述1. 概念植物細(xì)胞培養(yǎng)：是指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞，再通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量細(xì)胞群體的技術(shù)。它是在組培基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 5

12、0 細(xì)胞培養(yǎng)的目的不是使細(xì)胞形成組織以致更多的植物體，而是通過大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)獲得人類所需的細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物。與組織培養(yǎng)不同的是：512. 方法： 52根據(jù)培養(yǎng)對象根據(jù)培養(yǎng)基類型單細(xì)胞培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)（液體培養(yǎng)）固體培養(yǎng)3. 分類： 5354二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基無機(jī)鹽類：如硝酸鹽、銨鹽碳源：如蔗糖、葡萄糖植物生長激素：主要是生長素和細(xì)胞分裂素有機(jī)氮源：如某些蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，谷氨酰胺或氨基酸混合物復(fù)合物質(zhì)：細(xì)胞生長調(diào)節(jié)劑，復(fù)雜物質(zhì)。如：酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁、水果汁如椰子汁55三、 植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 1. 培養(yǎng)特性與微生物比較，植物細(xì)胞大。 懸浮培養(yǎng)時

13、，植物細(xì)胞易結(jié)團(tuán)（細(xì)胞數(shù)2200，直徑2mm）；易分泌粘多糖（硅油降低粘度），易產(chǎn)生泡沫（需消泡）。細(xì)胞有壁，易受剪切力高的裝置損傷。與微生物細(xì)胞相比，生長慢，周期長，分批需2-3周，半連續(xù)或連續(xù)需2-3個月。與微生物細(xì)胞比較，需光、好氣，CO2 / O2比要控制。單細(xì)胞3-5天內(nèi)可分裂，1周后形成小細(xì)胞團(tuán)，2周后可將小愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，連續(xù)光照，3周后可分化出試管苗。植物懸浮細(xì)胞生長與增殖可分為：延遲、對數(shù)生長、直線生長、減緩、靜止、衰亡期。 56572. 培養(yǎng)過程 585960四、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用 61第四節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交62一、原生質(zhì)體培養(yǎng)（技術(shù)線路，以經(jīng)濟(jì)海藻紅籬

14、為例） 63原生質(zhì)體：是指取出植物體細(xì)胞壁后獲得的裸露的植物細(xì)胞。 主要來源于各種植物的葉片、根尖等部位，也可從組織培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織中獲得。641. 定義：用兩個來自不同植物的體細(xì)胞融合成一個雜種細(xì)胞，且把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的方法。2. 優(yōu)勢：（與有性雜交方法比較）打破了不同種生物間的生殖隔離限制，大大擴(kuò)展了可用于雜交的親本組合范圍。 二、體細(xì)胞雜交 653. 基本步驟66(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖67基本過程獲得原生質(zhì)體獲得雜種細(xì)胞獲得雜種植株細(xì)胞A細(xì)胞B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B融合原生質(zhì)體雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株68 植物間的體細(xì)胞雜交所得到的雜交細(xì)胞，已達(dá)到了完整的植株水平，獲得了新的雜