凍存前后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和支持造血的研究

1、凍存前后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和支持造血的研究趙智剛，唐曉瓊，黎緯明，游泳，鄒萍【摘要】為了相識(shí)凍存清醒歷程對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(esenhyalsteell，S)生物學(xué)特性和支持造血本領(lǐng)的影響，接納通例要領(lǐng)分散造就骨髓S，將傳代后的細(xì)胞用含10二甲亞砜、40胎牛血清的ID細(xì)胞凍存液保存在-196液氮中，不雅察短期4周和中期9-15月清醒后S的活性、免疫表型、多向分化本領(lǐng)和支持造血的本領(lǐng)，并同凍存前的S舉行比力。結(jié)果表白：中短期凍存后的S的細(xì)胞活性別離為(90士3.75)和(93士2.51)；凍存后細(xì)胞的增殖本領(lǐng)、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細(xì)胞的本領(lǐng)、支持集落FU-G，F(xiàn)U-E，F(xiàn)U-G

2、E的生長(zhǎng)作用和凍存前S相似。結(jié)論：骨髓S在液氮中短期和中期保存后，細(xì)胞活性略有落落，但是并不影響S的增殖、分化和支持造血本領(lǐng)?！娟P(guān)鍵詞】支持造血BilgialharateristisandAbilityfSupprtingHeatpiesisfBnearresenhyalSteellsPre-andPst-ryp-reservatinAbstratThisstudyasaiedtbservethebilgialharateristisfrypreservedbnearresenhyalsteell(S)andtexainethEirabilitiestsupprtinvitrheatpiesi

3、s.BnearrSererypreservedin-196liquidnitrgenfr4eeks(shrtter)and9-15nths(ediuter)ithIDntaining10%DS，40%fetalalfseruasryprtetant.Theviability，prliferatin，iunphentype，invitrdifferentiatinandabilityfsupprtingheatpiesisfthaedSereinvestigatedandparediththesefpre-rypreservedS.Theresultsshedthattheellviabilit

4、yere(93士2.51)and(90士3.75)frSrypreservedaslngas4eeksr9-15nthsrespetively.Hever，thereerenhangesdeteted，asparedithpre-rypreservedSiniunphentype，abilitiesfprliferatinandsupprtinglnyfringfFU-G，F(xiàn)U-EandFU-GE.Itisnludedthatbnearr-derivedSanbestredinliquidnitrgenfrshrt-ter(4eeks)rediu-ter(9-15nths)ithuthange

5、sfabilitiesfprliferatin，differentiatinandheatpiesissupprt.Keyrdsrypreservatin;esenhyalsteell；heatpiesissupprt間充質(zhì)干細(xì)胞esenhyalsteell，S具有多向分化和支持造血的本領(lǐng)，并且泉源普及，輕易在體外造就和擴(kuò)增，如今已經(jīng)應(yīng)用于臨床并表現(xiàn)了精良的治療結(jié)果1-4。將造就后的S凍存，在患者必要S治療時(shí)賜與輸注，具有很好的臨床應(yīng)用遠(yuǎn)景。但是，凍存是否會(huì)影響S的生物學(xué)特性，我們尚不明晰。因此，本研究將骨髓泉源的S凍存于-196液氮中，不雅察中期和短期凍存后S的增殖、分化和支持造血的本領(lǐng)并同

6、凍存前的S舉行比力，為進(jìn)一步在臨床中的應(yīng)用提供細(xì)致的實(shí)行根據(jù)。質(zhì)料和要領(lǐng)試劑ID、DE、DF12、DB造就液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gib公司產(chǎn)物。鼠抗人D11b、D29、D31、D34、D44、D45、D105和HLA-DR抗體購(gòu)自Pharingen公司;rh-SF、G-SF、EP、IL-3購(gòu)自Peprteh公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤IBX和二甲亞砜DS購(gòu)自Siga公司。S的分散和造就骨髓來(lái)自8例康健志愿者年事18-34歲，均勻29歲。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細(xì)胞分散液密度1.077400g離心20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部門，計(jì)數(shù)后接種于含40%

7、DB、2%FS的DF12造就液中，置37、5%2造就箱中造就，24小時(shí)后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)70%融適時(shí)，通例消化傳代。S的凍存和清醒將1106細(xì)胞參加含10DS和40%FS的ID中，總體積1.8l。先置于-80冰箱中，第二天轉(zhuǎn)入-196中凍存。將中期9-15個(gè)月均勻13個(gè)月和短期4周凍存的S置于37水浴中快速?gòu)?fù)溫，凍融后參加8lID混勻后離心，然后再用ID洗滌1次，置于37、52造就箱中造就。第2天，調(diào)換奇怪造就液。細(xì)胞活性和增殖本領(lǐng)測(cè)定應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染接納率TBR試驗(yàn)檢測(cè)清醒細(xì)胞的活性，TBR(%)凍存后活細(xì)胞計(jì)數(shù)/凍存前活細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)拒染率100。將凍存前后的S接種在24孔板

8、中5103細(xì)胞/孔，置37、5%2造就箱中造就，每隔1天取2孔細(xì)胞舉行計(jì)數(shù)，盤算均值，繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞免疫表型闡發(fā)用含20g/LBSA的PBS將胰酶消化后的S制成1106ells/l的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中參加500l細(xì)胞懸液，先參加鼠抗人D11b、D29、D31、D34、D44、D45、D105和HLA-DR單克隆抗體，同時(shí)設(shè)空缺比較，于4孵育30分鐘，PBS洗3遍。再參加FIT標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗鼠IgG，4孵育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。利用ellquest軟件獵取并闡發(fā)數(shù)據(jù)。體外誘導(dǎo)多向分化檢測(cè)成骨誘導(dǎo)將5104細(xì)胞接種于6孔板中，參加含10-7l/L地塞米松、10l/

9、L磷酸甘油、0.05l/L維生素和10%FS的ID，3周后應(yīng)用vnKssa染色檢測(cè)鈣化小結(jié)。脂肪誘導(dǎo)將5104細(xì)胞接種于6孔板中，參加含10-6l/L地塞米松、0.5l/LIBX、0.1l/L維生素和10%FS的ID，7天后油紅染色檢測(cè)脂肪滴。支持造血的本領(lǐng)測(cè)定將凍存前后的骨髓S用10.0Gy60線照耀，然后調(diào)換為恒久造就液含12.5FS、12.5%馬血清、2l/L谷氨酰胺、10-6l/L氫化考的松的ID。獵取康健人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)先造就4小時(shí)以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞根據(jù)1106/l接種在照耀后的S中，在37、5%2條件下造就，每周半量換液。4周后獵取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測(cè)定其集

10、落形本錢領(lǐng)。造就體系為:ID中含30%馬血清、1%BSA，2l/L谷氨酰胺、110-4/L2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包羅:rhSF50ng/l，IL-310ng/l，G-SF50ng/l和EP4U/l。集落形成實(shí)行在24孔造就板中舉行，于37、5%2條件下造就14天。每孔接種1106個(gè)細(xì)胞。14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，50個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)接納SPSS11.0軟件舉行統(tǒng)計(jì)闡發(fā)，實(shí)行數(shù)據(jù)用均勻值尺度誤表現(xiàn)，組間比力應(yīng)用方差闡發(fā)。結(jié)果骨髓S的形態(tài)特性和生長(zhǎng)特點(diǎn)凍存后S的活性率和增殖本領(lǐng)凍存前后S的免疫表型通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存前后骨髓S的免疫表型創(chuàng)造，凍存

11、前后S均表達(dá)D29、D44、D105，而D11b、D31、D34、D45和HLA-DR均為陰性(表1)。D分子的表達(dá)量在凍存前后略有差異，但均不存在明顯性差異。Table1.Fl-ytetriphentypeanalysisfadultbnearrderivedSbefreandafterrypreservatin略多系分化的斷定成骨分化2周后細(xì)胞聚攏成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼承造就1周，細(xì)胞出現(xiàn)多層生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積，而比較組細(xì)胞仍為單層生長(zhǎng)，無(wú)鈣鹽沉積。vnKssa染色證明為鈣鹽沉積(圖A)，比較組無(wú)上述征象出現(xiàn)。成脂肪分化3-5天后創(chuàng)造少量細(xì)胞中有小脂肪滴出現(xiàn)，繼承誘導(dǎo)，1

12、周后可以瞥見(jiàn)大部門細(xì)胞胞體變大，胞漿出現(xiàn)大量脂肪滴，油紅染色證明為脂肪滴(圖B)，而比較組細(xì)胞胞漿中無(wú)脂肪滴出現(xiàn)，油紅染色為陰性。凍存后的S同樣具有成骨和成脂肪分化本領(lǐng)(圖，D)。支持造血作用為了評(píng)估凍存是否影響S支持造血的本領(lǐng)，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于照耀過(guò)的凍存前和清醒的S中，在恒久骨髓造就液中造就4周后檢測(cè)FU天生環(huán)境。如表2所示，凍存前后S均具有支持造血作用。FU-G，F(xiàn)U-E和FU-GE的產(chǎn)率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后S為滋養(yǎng)層的骨髓恒久造就體系中并無(wú)明顯性差異。Table2.HeatpiesissupprtedbySinlngterbnearrulture略討論S是造血微環(huán)境中

13、重要構(gòu)成部門，通過(guò)合成、排泄多種造血因子和黏附分子來(lái)調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。既往研究表現(xiàn)，S可以合成并排泄多種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有維持恒久造就起始細(xì)胞(LT-I)的本領(lǐng)，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化5。團(tuán)結(jié)S的移植方案還可以促進(jìn)HS的植入和移植后的造血規(guī)復(fù)6。但是，在體外造就擴(kuò)增中，S的增殖本領(lǐng)會(huì)漸漸落落并產(chǎn)生分化，支持造血的本領(lǐng)削弱。將擴(kuò)增后大概增殖茂盛的S舉行凍存，在必要的時(shí)間清醒造就，可以有用地解放上述題目并確保提供充足的S應(yīng)用于臨床。既往的大量研究表現(xiàn)，造血干細(xì)胞可以在液氮中恒久凍存，清醒后仍舊具有精良的造血重修本領(lǐng)。但是，S顛末低溫凍存和清醒，其增殖和分化本領(lǐng)、支持造血

14、成效是否受影響，尚不明白。因此，我們不雅察了骨髓S顛末短期4周和中期9-15月凍存后的生物學(xué)特性和支持造血本領(lǐng)。結(jié)果表現(xiàn)，顛末中期和短期凍存后S的形態(tài)并未產(chǎn)生改變，仍為梭形，貼附在造就瓶底。凍存后S的活性略有落落，但凍存并不影響細(xì)胞的增殖本領(lǐng)，凍存前和中期、短期凍存后S的倍增時(shí)間在40小時(shí)擺布，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)不具有明顯性差異。通過(guò)FAS檢測(cè)，凍存前后的S的免疫表型沒(méi)有顯著改變，表現(xiàn)為D29、D44和D105為陽(yáng)性，而D11b、D34、D31、D45、和HLA-DR為陰性。多向分化本領(lǐng)是S的重要特性之一，我們將顛末中期和短期凍存后S誘導(dǎo)向脂肪和骨分化，結(jié)果表現(xiàn)凍存后S仍舊具有向脂肪和骨分化的本領(lǐng)，

15、并且這種分化本領(lǐng)，并不隨著清醒后細(xì)胞的傳代而產(chǎn)生變革。由此可見(jiàn)，中期和短期凍存并不影響S的生物學(xué)特性。支持造血是骨髓S的緊張成效之一，凍存后S支持造血本領(lǐng)是否產(chǎn)生變革將直接影響S的臨床應(yīng)用。ajudar等7的研究表現(xiàn)，骨髓S可以排泄多種造血生長(zhǎng)因子，具有支持造血作用，能促進(jìn)骨髓泉源的FU-G，F(xiàn)U-E，F(xiàn)U-eg和FU-GE的增殖。但是凍存后S支持造血本領(lǐng)怎樣變革，既往并無(wú)報(bào)道。在本實(shí)行中，我們通過(guò)檢測(cè)體外恒久造就體系中集落形成環(huán)境來(lái)評(píng)估凍存后S對(duì)造血干細(xì)胞的支持作用。骨髓單個(gè)核細(xì)胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后S作為滋養(yǎng)層的骨髓恒久造就體系中造就，4周后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的FU天生率在各體系

16、之間沒(méi)有明顯性差異。這說(shuō)明顛末中期和短期凍存后S仍具有支持造血本領(lǐng)，同凍存前比力，支持造血本領(lǐng)沒(méi)有顯著變革。進(jìn)一步闡發(fā)上述差異造就體系中FU-G、FU-E和FU-GE的天生環(huán)境，結(jié)果表白：凍存前后S均可以促進(jìn)FU-G、FU-E和FU-GE的增殖，并且S促進(jìn)定向祖細(xì)胞的增殖本領(lǐng)在凍存前后沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表白，凍存并不影響S促進(jìn)差異階段造血祖細(xì)胞增殖、分化的本領(lǐng)。綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)行開(kāi)端證明：顛末中期和短期低溫凍存的骨髓S并不改變其固有的生物學(xué)特性。固然凍存可以導(dǎo)致部門細(xì)胞損傷，但是并不影響剩余細(xì)胞的增殖本領(lǐng)和多向分化本領(lǐng)。別的，凍存后的S仍舊具有支持造血的成效。但是，凍存后S是否在

17、體內(nèi)仍具有上述生物學(xué)性狀和支持造血成效，尚需進(jìn)一步研究證明?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1JiangY，JahagirdarBN，REinhardtRL，etal.Pluriptenyfe-senhyalsteellderivedfradultarr.Nature，2002;4186893:41-492KrauseDS，TheiseND，lletrI，etal.ulti-rgan，ulti-lineageengraftentbyasinglebnearr-derivedsteell.ell，2001;105:369-3773NrtA，KruisselbrinkAB，int-AnkerPS，etal.esenh

18、yalsteellsprteengraftentfhuanubilialrdbld-derivedD34(+)ellsinND/SIDie.ExpHeatl，2002;30:870-8784KN，GersnSL，perB，etal.Rapidheatpietire-veryafterinfusinfautlgus-bldsteellsandulture-expandedarresenhyalsteellsinadvanedbreastanerpatientsreeivinghigh-dsehetherapy.Jlinnl，2000;18:307-3165ajudarK，ThiedeA，saJD，etal.Phentypiandfuntinalparisnfulturesfarr-derivedesenhyalsteells(Ss)andstralells.JellPhysil