肺癌PDX動物模型建立

1、 惡性肺結(jié)節(jié)/肺癌PDX動物模型及分子評價體系建立一研究背景1臨床治療的問題化療/靶向治療中90%達(dá)不到預(yù)期治療效果，表明目前的評價腫瘤藥物療效的動物模型局限性較大。腫瘤動物模型對藥物反應(yīng)的預(yù)測價值在于該模型能在多大程度上真實模擬人體內(nèi)的真實腫瘤環(huán)境，如腫瘤發(fā)生、微血管形成、免疫反應(yīng)、腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞浸潤和腫瘤基質(zhì)成分，同時還應(yīng)該能模擬人體藥物反應(yīng)如耐藥性的產(chǎn)生。然而目前尚無系統(tǒng)的報道介紹實驗預(yù)測和最終臨床效果的相關(guān)性，尤其是針對靶向治療。2PDX模型的選擇原則（1）標(biāo)本選擇時必須到相關(guān)的臨床分期，多數(shù)抗癌藥物表現(xiàn)出階段性特異的效果，如胰腺癌的藥物BB-94就是早期時抗腫瘤效果明顯，但對進(jìn)

2、展期無效；（2）需檢測藥物與腫瘤各成分細(xì)胞的相互作用（如：腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤-浸潤的免疫細(xì)胞等）；（3）應(yīng)該確定藥效學(xué)與藥代動力學(xué)的關(guān)系，以確定人和小鼠之間藥效和毒性的關(guān)系。藥代/藥效的關(guān)系可通過驅(qū)動基因突變來確定（如EGFR，Hedgehog信號通路），但對針對基質(zhì)及腫瘤微環(huán)境的藥物的價值尚待確定；（4）成功的藥效/藥代模型用于預(yù)測人對藥物的劑量反應(yīng)需要尋找人和小鼠中的生物標(biāo)志物；（5）如何解決靶向藥物的脫靶作用以及非腫瘤組織表面的靶點的作用；（6）如何控制轉(zhuǎn)移及研究藥物在抑制轉(zhuǎn)移中的作用。3臨床研究動物模型現(xiàn)狀及問題目前主要的臨床前小鼠模型分為兩類：（1）移植瘤模型：包括

3、人腫瘤細(xì)胞系接種、自體移植模型和患者來源移植模型；是將人源或同源小鼠腫瘤組織接種于皮下或相關(guān)原位部位；此模型針對細(xì)胞增殖及存活的藥物可用于預(yù)測臨床效果，但對靶向藥物的價值有限，尤其是針對腫瘤微環(huán)境的藥物；（2）遺傳調(diào)控小鼠模型：包括遺傳調(diào)控腫瘤模型和非遺傳調(diào)控腫瘤模型。通過遺傳工程人為導(dǎo)致小鼠基因突變并誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，這種模型是基于通過二代測序發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動基因突變建立的突變小鼠模型。問題：（1）腫瘤異質(zhì)性使得藥物針對腫瘤不同細(xì)胞成分的方式及耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制仍不清楚，腫瘤中不同細(xì)胞的相互作用，更增加了這個問題的復(fù)雜程度；（2）動物模型和臨床結(jié)果之間結(jié)果的一致性仍有差距，如腫瘤的抑制效率、無進(jìn)展期生存

4、、總生存、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況；（3）移植模型與人的基因型及表型缺乏足夠準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物來驗證其匹配性。4PDX動物模型在肺癌中的研究現(xiàn)狀小細(xì)胞肺癌:未經(jīng)化療的SCLC組織，經(jīng)處理后移植入SCID小鼠皮下，腫瘤長到1cm后傳代，同時發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)移到附近淋巴組織；采用Affymetrix檢測平臺，對源組織、移植腫瘤、移植腫瘤中分離的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)在移植腫瘤中出現(xiàn)基因表達(dá)丟失現(xiàn)象，結(jié)論認(rèn)為基因表達(dá)變化是該類模型中常見的現(xiàn)象，不影響期作為藥物測試模型的價值；非小細(xì)胞肺癌：來自早期（T2/T3）肺癌患者102例手術(shù)標(biāo)本，成功建立25例PDX模型，檢測表明早期傳代（P5代）的移植腫瘤與源腫瘤組織相比

5、在形態(tài)學(xué)及突變位點等方面匹配性很強(qiáng)；化療后PDX模型也出現(xiàn)和臨床治療后相似的現(xiàn)象，表明PDX模型可做為肺癌患者化療的檢測模型；同時檢測到EGFR、P53的新發(fā)突變位點，可做為化療效果預(yù)測的標(biāo)志物；大細(xì)胞癌:25例大細(xì)胞癌組織建立PDX模型，用厄羅替尼和西妥昔單抗治療，腫瘤縮小40%即可認(rèn)為對治療有反應(yīng)；對每一腫瘤組織進(jìn)行RNA表達(dá)譜檢測，與分子信號圖譜（molecularsingalingmap,MSM）比對，預(yù)測腫瘤對藥物的反應(yīng)，結(jié)果PDX對西妥昔單抗的反應(yīng)率為40%，對厄羅替尼反應(yīng)率為20%，MSM預(yù)測的反應(yīng)率中西妥昔單抗和厄羅替尼分別為48%和40%。結(jié)論認(rèn)為MSM可用于藥物反應(yīng)的預(yù)測。

6、目前PDX模型應(yīng)該解決的問題：PDX模型中應(yīng)該增加生物標(biāo)志物的種類及評估方式，以對患者分類及臨床藥效檢測有幫助作用；需要從患者/PDX模型來進(jìn)行雙重篩選以得到可用于腫瘤進(jìn)程監(jiān)測的標(biāo)志物。SinghM,FerraraNetal.Modelingandpredictingclinicalefficacyfordrugstargetingthetumormilieu.NatureBiotech.30:648-657,2012TentlerJJ,TanAC,WeekesCDetal.Patients-derivedtumorxenograftsasmodelsforoncologydrugdevelo

7、pment.Nat.Rev.Clin.Oncol.9:338-350,2012MalaneyP,NicosiaSV,DaveV.Onemouse,onepatientparadigm:newavatarsofpersonalizedcancertherapy.CancerLetters2013PalmaMD,HanahanD.Thebiologyofpersonalizedcancermedicine:facingindividualcomplexitiesunderlyinghallmarkcapabilities.Mol.Oncol.6:111-127,2012HoffmanRM.Pati

8、ents-derivedorthotopicxenografts:bettermimicofmetastasisthansubcutaneousxenografts.Nat.Rev.Can.15:451-452,2015GaoH,KornJ,FerrettiSetal.High-throughputscreeningusingpatient-derivedtumorxenograftstopredictclinicaltrialdrugresponse.Nat.Med.21:1318-1325DanielV,MarchionniL,HiermanJSetal.Aprimaryxenograft

9、modelofsmall-celllungcancerrevealsirreversiblechangesingeneexpressionimposedbycultureinvitro.CancerRes.69:3364-3373,2009DongX,GuanJ,EnglishJCetal.Patient-derivedgenerationxenograftsofnon-smallcelllungcancers:Promisingtoolsforpredictingdrugresponsesforpersonalizedchemotherapy.16:1442-1451,2010Fichtne

10、rI,RolffJ,SoongRetal.Establishmentofpatients-derivednon-smallcelllungcancerxenograftsasmodelsfortheidentificationofpredictivebiomarkers.Clin.Can.Res.14:6456-6468,2008二最終目標(biāo)建立惡性肺結(jié)節(jié)病程監(jiān)控和早期治療的PDX模型及評價標(biāo)準(zhǔn)三具體目標(biāo)評估PDX模型在惡性肺結(jié)節(jié)病程監(jiān)控、早期治療中的價值；評估患者體內(nèi)分離的CD4+T淋巴細(xì)胞對肺癌的治療效果；3篩選并鑒定可分別用于肺部惡性結(jié)節(jié)病程監(jiān)測、藥物反應(yīng)效果評估及耐藥預(yù)測、CD4+T淋巴

11、細(xì)胞治療效果的多組學(xué)生物標(biāo)志物；4.評估PDX模型中不同的腫瘤接種方式（皮下、腎小囊、尾靜脈）與源組織的匹配性，及對藥物治療的敏感程度。四研究內(nèi)容（一）肺部惡性結(jié)節(jié)的病程監(jiān)測、早期治療效果評估腫瘤傳代1穿刺標(biāo)本接種SCID小鼠（皮下、腎小囊）（P1）,腫瘤長到直徑400-600mm3后處死小鼠并取出腫瘤組織；剪碎及消化為單個細(xì)胞后接種第二批SCID小鼠（皮下、腎小囊、尾靜脈注射）（P2代），同時收集P1代腫瘤組織進(jìn)行蛋白組學(xué)、表觀遺傳譜、驅(qū)動基因等檢測；P2代小鼠1個月后處死，取出腫瘤組織后再次接種SCID小鼠（P3代），同時收集P2代腫瘤組織進(jìn)行多組學(xué)檢測，并與P1代腫瘤組織對比，評估其一致

12、性；以后每2月傳代一次，并收集腫瘤組織進(jìn)行多組學(xué)檢測，評估腫瘤不同代數(shù)的匹配性；腫瘤傳代不能超過10代；早期治療評估P3代開始進(jìn)行藥物治療，根據(jù)EGFR的檢測結(jié)果并與臨床醫(yī)生討論后確定化療方案或靶向治療方案；每兩天測量一次腫瘤大小，評估早期治療效果；每兩周進(jìn)行PET-CT掃描，檢測腫瘤的代謝變化。（二）T淋巴細(xì)胞的免疫治療腫瘤傳代選用肺結(jié)節(jié)患者穿刺標(biāo)本、晚期肺癌患者手術(shù)標(biāo)本，其余步驟同上。免疫治療及評估每次肺結(jié)節(jié)患者隨訪后，抽取外周血，分離效應(yīng)T細(xì)胞；富集后刺激T細(xì)胞增殖；通過尾靜脈注射到PDX模型中；通過測量腫瘤組織大小及PET-CT掃描，評估T淋巴細(xì)胞治療效果。（三）生物標(biāo)志物篩選及鑒定收

13、集不同代數(shù)（P1-P10代）、不同治療方案（T細(xì)胞治療/化療/靶向治療）、不同組織來源（肺結(jié)節(jié)穿刺標(biāo)本/進(jìn)展期手術(shù)標(biāo)本）的PDX腫瘤組織，并結(jié)合取自患者體內(nèi)的源組織，進(jìn)行基因組學(xué)、表觀遺傳圖譜、蛋白精確定量等檢測方法，篩選在治療前和治療后的腫瘤組織中特異的DNA分子、甲基化/磷酸化位點、蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物；2結(jié)合生物信息學(xué)方法，設(shè)計不同的生物標(biāo)志物組合，用于不同治療方案（T細(xì)胞治療/化療/靶向）對肺癌治療效果的評估；同時評價生物標(biāo)志物對預(yù)測患者藥物反應(yīng)的價值；3選擇在肺結(jié)節(jié)來源PDX模型中差異較明顯的驅(qū)動基因、表觀遺傳位點、蛋白分子標(biāo)志物，結(jié)合患者的隨訪信息、影像學(xué)資料及臨床病程，評估PDX模型

14、篩選惡性肺結(jié)節(jié)病程監(jiān)測的標(biāo)志物方面的價值。五技術(shù)路線惡性肺結(jié)節(jié)穿刺標(biāo)本手術(shù)切除標(biāo)本六進(jìn)度安排截止2017年12月底，完成100例肺結(jié)節(jié)穿刺標(biāo)本/肺癌手術(shù)組織的PDX接種實驗，并篩選可用于肺結(jié)節(jié)病程監(jiān)測、不同治療方案藥物反應(yīng)預(yù)測的分子標(biāo)志物組合。七詳細(xì)操作流程（一）皮下接種操作流程1病人腫瘤標(biāo)本的收集：盡可能在腫瘤離體后立即收集，標(biāo)本可來源于組織活檢和腫瘤根治手術(shù)標(biāo)本。新鮮腫瘤組織最好取腫瘤靠近邊緣、壞死較少的腫瘤組織，完全浸泡于0C帶或不帶血清、0.05%青霉素及鏈霉素雙抗PRMI1640培養(yǎng)基中；清洗后轉(zhuǎn)移到帶上述培養(yǎng)基的消毒培養(yǎng)皿中（0C）,完全浸泡并帶回動物房操作；用消毒組織剪將腫瘤組織

15、修剪成2x2x3mm,并用以上培養(yǎng)基中清洗3遍。（接種前在基質(zhì)膠上拌一下，加一滴基質(zhì)膠成瘤率70%以上）；4麻醉下的4-6周齡的SCID小鼠或者裸鼠皮下后兩側(cè)皮膚各開一個約3mm小口，并分離出一個小口袋狀空間，將修剪的腫瘤小塊組織種植于皮下，縫合皮膚剪口。（P1代時，為了節(jié)約小鼠用量，我們一只小鼠會接種2-4個點，在四肢后側(cè)（腋下及大腿根部）。從P2代開始只接種一個點，右前肢腋下。每個點組織約為2x2x2mm大小，差不多米粒那么大。注意剔除壞死組織）；5在切口滴一滴100*雙抗溶液防止傷口感染；6.剩余組織儲存于-80C冰箱或制作石蠟切片待以后做進(jìn)一步的分析；7每種腫瘤都分別接種于5只小鼠，至

16、少每周觀察一次種植腫瘤情況。觀察內(nèi)容包括有無腫瘤生長及測量腫瘤的長、寬并計算腫瘤的體積；8在接種腫瘤的第一周，在移植部位可以看到一個隆起的小結(jié)，然后會消失，約在12-16周后移植腫瘤才開始生長成1-2cm大小。（二）腎包膜移植方案1將臨床切下的腫瘤立刻放入裝有1640培養(yǎng)基的無菌瓶內(nèi)，以備小鼠移植手術(shù)的使用（動物類型：SCID小鼠，體重：1620g，雌雄均可，北京華阜康生物科技有限公司）；腫瘤移埴前，用0.22mol/L合氯醛溶液腹腔注射麻醉動物，劑量為0.012ml/g；小鼠取倒臥位，腎區(qū)皮膚消毒，作一長0.5cm切口，牽拉輸尿管暴露腎臟；將剪切成lmmxlmmxlmm的瘤塊裝入套管針后穿入腎包膜；4膜下移植確保手術(shù)在2.5h內(nèi)完成；測量用目鏡內(nèi)裝有測微尺的解剖顯微鏡測量移