放射免疫實驗

1、關(guān)于放射免疫實驗第一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月體外放射分析技術(shù)利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進(jìn)行體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測定。競爭性放射分析放射免疫分析（RIA）非競爭性放射分析免疫放射分析（IRMA）第二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 待測物質(zhì)濃度與檢測手段 臨床化學(xué)分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitamins

2、Serum Proteins第三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三章 放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用第四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月放射免疫分析的創(chuàng)立1959 美國Yalow & Berson1960 英國 Ekims1977 獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析的里程碑第五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1959年，Yalow和Berson創(chuàng)立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。這種方法結(jié)合了放射性核素測量的高靈敏性和免疫抗原-抗體反應(yīng)的高特異性兩大特點，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的先河。女科學(xué)家

3、R.Yalow放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）第六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原理Ag + Ab Ag-Ab + Ag* Ag*-Ab 競爭結(jié)合：放射性標(biāo)記的抗原（Ag*）和非標(biāo)記的抗原（Ag）在同一反應(yīng)系統(tǒng)中與特異性抗體（Ab）的競爭性結(jié)合。第七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月在上反應(yīng)式中：Ag與Ag*的免疫活性相同，即與Ab有相同的親和力；Ab的結(jié)合位點數(shù)Ag或Ag*，但Ag+Ag*；Ag*與Ab的量是恒定的，Ag是待測量。第八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二種抗原(Ag 、Ag*)與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比例，Ag量

4、多，則AgAb結(jié)合多，Ag*Ab結(jié)合量就少，即Ag*Ab將隨Ag的增加而減少，呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為函數(shù)關(guān)系。在系統(tǒng)中，Ag*Ab的量可通過測定放射性而獲得，再根據(jù)函數(shù)關(guān)系求Ag的量。第九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月+BoundFreeAgAb第十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線又稱為劑量反應(yīng)曲線，以一系列遞增濃度的Ag及一定量的Ag*與恒定量限量的Ab競爭結(jié)合反應(yīng)而得，是對待測物進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。第十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)準(zhǔn)曲線實例 第十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)準(zhǔn)曲線: 配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中

5、加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B。B0為標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度=0時的放射性值。第十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月放免分析基本條件（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原（二）特異性抗體（三）標(biāo)記抗原（四）分離技術(shù)第十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月a. 概念：是指已知真實含量，且不含對免疫反應(yīng)產(chǎn)生干擾雜志的抗原。b. 用途： 免疫動物制備抗體Ab 放射性核素標(biāo)記Ag* 繪制劑量反應(yīng)曲線c. 要求： 高純度 高準(zhǔn)確度 良好的穩(wěn)定性 （一）標(biāo)準(zhǔn)抗原 第十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）特異性抗體 a. 對特異性結(jié)合抗體的要求

6、：1親和力 （affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用 親和常數(shù)Ka 值表示，反映靈敏度，Ka應(yīng)達(dá)1091012mol/L。2特異性高：與待測抗原的結(jié)合力高，而與待測抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)率）低。3滴度 （效價）高：指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應(yīng)的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價越高。4穩(wěn)定性好：能長期保存，化學(xué)性質(zhì)、效價穩(wěn)定。第十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月b. 抗血清的制備：1.大分子物質(zhì)可直接免疫動物誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但是小分子物質(zhì)為半抗原，必須與載體結(jié)合制成人工抗原（半抗原-蛋白

7、質(zhì)），才能進(jìn)行免疫。2選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊。3應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油 +卡介苗）。4選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點）、間隔時間（加強(qiáng)）與次數(shù)。第十七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 c.單克隆抗體的使用： 特異性高 親和力低，不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體第十八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月對標(biāo)記抗原的要求：1放射性比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強(qiáng)度高，一般至少達(dá)到370GBq/mmol。2免疫活性：與標(biāo)記前一致。3放射化學(xué)純度高：應(yīng) 95%。4穩(wěn)定性好：標(biāo)記的同位素不易脫落。（三）標(biāo)記抗原 第十九張，P

8、PT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月常用標(biāo)記核素：（1）125I： 射線，半衰期 60 天（2）3H： 射線，半衰期 12.3 年測量儀器：（1） 計數(shù)儀（2）液體閃爍計數(shù)器 第二十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月兩種標(biāo)記方法的優(yōu)缺點 3H標(biāo)記物 125I 標(biāo)記物 貨架期長 貨架期短以3H置換H，對原物質(zhì) 以125I取代H，可能影響 免疫活性無改變 免疫活性 標(biāo)記難度大，比活度低 標(biāo)記方法簡單，比活度高 射線測量效率低 射線測量效率高 廢棄物處理較困難 廢棄物處理較容易第二十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月a. 對分離方法的要求：1使抗原-抗體復(fù)合物（B）與游離抗原（F）

9、盡可能分離完全；2分離后便于放射性測量；3分離效果不受外界干擾因素的影響；4 操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好；5與游離標(biāo)記物的非特異性結(jié)合盡可能小；6. 試劑來源廣泛、價格低廉。（四）分離技術(shù) 第二十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月b. 常用的分離方法 1. 雙抗體法特點： 分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價高，但分離時間長，成本高。第二十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）特點： 快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大3. 雙抗體PEG法將雙抗體和沉淀法兩者結(jié)合進(jìn)行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點，并克服了雙抗體分離時間長和沉淀法非特異性

10、結(jié)合高的缺點。第二十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4固相分離法將抗體通過特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應(yīng)在固相載體上完成，達(dá)到平衡后形成固相的Ag-Ab復(fù)合物，可與游離部分分離。此方法具有操作簡便，迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低等優(yōu)點。第二十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5.磁化分離法6.葡萄球菌A蛋白分離法（SPA分離法） 7. 微孔濾膜法 第二十七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月放免分析的優(yōu)點靈敏度高特異性強(qiáng)精確度高用血量少缺點：污染；放射性核素衰變及不穩(wěn)定第二十八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于202

11、2年6月第三章 放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用第二十九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1968年，Miles和Hales創(chuàng)立了免疫放射分析法（IRMA）。IRMA與IRA不同，它是將放射性核素標(biāo)記在抗體上，而不是標(biāo)記在抗原上。同時所用的標(biāo)記抗體與待測抗原比較是過量的。 Ag+Ab* Ag-Ab*+Ab* B F由上式可見， IRMA不存在競爭反應(yīng)，是待測抗原直接與標(biāo)記抗體反應(yīng)。待測抗原的量與抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的量成正相關(guān)關(guān)系。 免疫放射分析法（immunoradiometric assay，IRMA）第三十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.單位點IRM

12、A單位點（one-site）IRMA是利用過量的標(biāo)記抗體（Ab*）與待測抗原（Ag）進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，形成抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，再用固相抗原免疫吸附劑（SP-Ag）與剩余的標(biāo)記抗體結(jié)合，并將其分離。第三十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.雙位點IRMA將抗體1結(jié)合于固相表面，加入標(biāo)本后，待測抗原與固相抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，并留在固相表面。洗去其他物質(zhì)后，加入標(biāo)記抗體2，在固相表面形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，再洗去多余標(biāo)記抗體，即可達(dá)到分離目的。第三十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月競爭性分析與非競爭分析的比較第三十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于

13、2022年6月第三章 放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用第三十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月放射免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用一 甲狀腺疾病二 代謝類疾病三 骨和礦物質(zhì)代謝四 腫瘤五 心血管疾病六 器官移植中的藥物監(jiān)控第三十五張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一 甲狀腺疾病TSH 促甲狀腺激素STSH 高靈敏度甲狀腺激素FT3 血清游離三碘甲狀腺原氨酸 FT4 游離甲狀腺素 TgAb 抗甲狀腺球蛋白抗體TmAb抗甲狀腺微粒體抗體第三十六張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床上確診為甲狀腺功能亢進(jìn)的步驟STSH,FT3,FT4STSH,FT3,FT4STSH,

14、FT3,FT4正常STSH,FT3,FT4正常確診甲亢攝131率攝131率攝131率攝131率T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫，F(xiàn)T4有時）攝131率攝131率T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫）攝131率攝131率或正常攝131率毒性彌漫性甲腫（Graves病）多結(jié)節(jié)甲腫（結(jié)節(jié)性甲亢）大的單個結(jié)節(jié)（自主性結(jié)節(jié)甲亢）有甲腫時多為：亞甲炎伴甲亢碘致甲亢甲狀腺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌伴甲亢無甲腫時多為醫(yī)源性甲亢第三十七張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床上確診為甲狀腺功能減退的步驟STSH,FT4STSH,FT4原發(fā)性甲低有甲狀腺腫無甲狀腺腫抗甲狀腺抗體陽性131I治療后甲狀腺手術(shù)后或

15、甲腺外照射無甲狀腺腫克丁病橋本甲狀腺炎抗甲狀腺抗體陰性激素合成障礙藥物引起（碘、鋰）碘缺乏癥（地甲腫）抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陰性第三十八張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二 代謝類疾病胰島素原（proinsulin）正常生理條件下，胰島素原分子釋放很少，占總分泌5%-10%，因此不考慮其對胰島素測定的影響。在病理情況下，如胰島素瘤，血中胰島素原可達(dá)50%-70%。目前，市場上已有用純胰島素原做為標(biāo)準(zhǔn)品的放免藥盒，可用來直接測定血清或血漿中的胰島素原含量。第三十九張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月人真胰島素(insulin specific)不經(jīng)處理的血漿，

16、通過放免法測得的胰島素稱為免疫反應(yīng)性胰島素（IRI），IRI與胰島素原有明顯的交叉反應(yīng)，當(dāng)血清中胰島素原含量較高時，應(yīng)考慮對胰島素測定的影響。人真胰島素放免分析可特異性測定人血清中與胰島素原無交叉反應(yīng)的胰島素水平，是確切評價細(xì)胞功能和胰島素敏感性的關(guān)鍵指標(biāo)。第四十張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三 骨和礦物質(zhì)代謝1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D體內(nèi)維生素D經(jīng)日光紫外線照射、且在C1和C25位羥基化后，才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘木S生素D代謝物。測定血清中1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D的濃度可鑒別與維生素代謝有關(guān)的疾病。目前國內(nèi)用維生素D放免藥盒用于維生素D缺乏癥、骨營養(yǎng)不良、

17、肝炎和藥物性維生素D紊亂、甲狀旁腺功能亢進(jìn)或減退的測定。第四十一張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）CT及PTH參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制：當(dāng)血鈣降低時，PTH分泌增加，作用于骨促進(jìn)溶骨，鈣自骨釋出，同時作用于腎使腎小管對鈣回吸增多。血鈣上升則刺激甲狀腺分泌CT抑制骨鈣釋放，同時促進(jìn)腎小球?qū)︹}的排出。CT和PTH的分泌功能彼此成反饋關(guān)系，機(jī)體通過它們互相拮抗作用維持代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。降鈣素和甲狀旁腺激素對鈣代謝的調(diào)節(jié)不僅取決于它們在血中含量的絕對值，更重要是它們的比值。因此測定它們的比值對內(nèi)分泌代謝病研究很有價值。第四十二張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022

18、年6月骨鈣素（OC）骨鈣素由成骨細(xì)胞合成，在合成過程中不斷有少量骨鈣素釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，骨鈣素的水平直接反映骨骼生成狀況，其檢測可以幫助評價骨骼更新程度，高水平的骨鈣素與骨代謝病相關(guān)。整分子骨鈣素放免藥盒（intact OC IRMA kit）可以用于軟骨病、Paget骨病、甲狀腺功能亢進(jìn)、腎性營養(yǎng)不良、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的檢測。第四十三張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月四 腫瘤甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白作為一種腫瘤特異性抗原，對早期診斷原發(fā)性肝癌具有較高靈敏性和特異性。陽性率在60%85%。癌胚抗原（CEA）癌胚抗原首先是從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，癌胚抗原升高和消化道腫瘤密切相關(guān)。胃癌患者陽性率可高達(dá)50%以上。第四十四張，PPT共四十九頁，創(chuàng)作于2022年6月糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）CA50胰腺癌、肝癌、結(jié)、直腸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肺癌、食道癌。CA19-9對胰腺癌和膽囊癌診斷有較高特