應(yīng)用微生物與免疫學(xué)套課件幻燈片完整版ppt教學(xué)教程最全電子講義(最新)

1、 病 毒第一節(jié) 病 毒非細(xì)胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分亞病毒類病毒：只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)特點(diǎn)： 無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生； 沒(méi)有酶或酶系統(tǒng)極不完全，不能進(jìn)行代謝活動(dòng)； 個(gè)體極小，能通過(guò)細(xì)菌濾器； 對(duì)抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。病毒是超顯微的，沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實(shí)體。它們?cè)诨罴?xì)胞外具有一般化學(xué)大分子特征，一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞又具有生命特征。一、病毒的形態(tài)構(gòu)造和化學(xué)成分（一）病毒的大小個(gè)體小，必需在電鏡下觀察；不同病毒的毒粒大小差別很大；毒粒的形狀大致可分球形顆粒(或稱擬球形顆粒)、桿狀顆粒和復(fù)雜形狀顆粒

2、（如蝌蚪狀，卵形）等少數(shù)幾類。（二）病毒的形態(tài)1、典型病毒粒的構(gòu)造基本成分核酸位于中心，稱為核心蛋白質(zhì)包圍在核心周圍，形成衣殼核心和衣殼合稱核衣殼，為病毒的基本結(jié)構(gòu)。有些復(fù)雜的病毒在衣殼的外面包裹著一層由脂類和多糖組成的包膜。有的包膜上還長(zhǎng)有刺突。2、病毒粒的對(duì)稱體制螺旋對(duì)稱二十面體對(duì)稱復(fù)合對(duì)稱無(wú)包膜有包膜無(wú)包膜有包膜無(wú)包膜有包膜3、病毒的群體形態(tài)噬菌體感染細(xì)菌后，使細(xì)菌細(xì)胞破裂死亡，連續(xù)重復(fù)感染使大量的細(xì)菌死亡，在培養(yǎng)細(xì)菌的平板上，可以看到一個(gè)個(gè)透明不長(zhǎng)細(xì)菌的小圓斑，稱為噬菌斑。人工培養(yǎng)的單層動(dòng)物細(xì)胞感染病毒后，也會(huì)形成類似噬菌斑的動(dòng)物病毒群體，稱為空斑。單層動(dòng)物細(xì)胞受到腫瘤病毒的感染后，會(huì)

3、使動(dòng)物細(xì)胞惡性增生，形成類似細(xì)菌菌落的病灶，稱為病斑。煙草花葉病毒感染煙草后，在葉片上出現(xiàn)的一個(gè)個(gè)壞死的病灶，稱為枯斑。1、螺旋狀對(duì)稱型：煙草花葉病毒（TMV） 呈直桿狀，長(zhǎng)300nm，寬15nm，中空內(nèi)徑4nm，由158個(gè)氨基酸組成一個(gè)皮鞋狀的衣殼粒，相對(duì)分子量為17500，總共2130個(gè)衣殼粒，排列成130圈螺旋，核酸核心是單鏈的RNA，相對(duì)分子質(zhì)量為260萬(wàn)，含有6390個(gè)核苷酸，每3個(gè)核苷酸與一個(gè)衣殼粒相結(jié)合，盤繞于蛋白質(zhì)的中空內(nèi)徑中。（三）3類典型形態(tài)的病毒及其代表 二十面體具有12個(gè)角、20個(gè)面 和30條棱。腺病毒的衣殼是典型的二十面體對(duì)稱， 由252個(gè)衣殼組成，沒(méi)有包膜。腺病毒的

4、核心是由線狀雙鏈DNA構(gòu)成的。 其基因組的大小都約為36500個(gè)核苷酸對(duì)。2、二十面體對(duì)稱型： T4由頭部（核心是雙鏈線狀DNA）、頸部和尾部（尾鞘、尾管、基板、刺突和尾絲）三個(gè)部分構(gòu)成。3、復(fù)合對(duì)稱型：偶數(shù)噬菌體4、 病毒的核酸 核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；控制著病毒的增殖及對(duì) 宿主的感染性； 一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或是RNA；病毒核酸單鏈DNA（ss DNA）；雙鏈DNA（ds DNA）；單鏈RNA（ss RNA）；雙鏈RNA（ds RNA）；二、四類病毒及其繁殖方式（一）原核生物的病毒噬菌體與其他病毒一樣，噬菌體除有其特異性宿主外，并無(wú)顯著區(qū)別。它們都是由蛋白質(zhì)和核酸組成?；拘?/p>

5、態(tài)為蝌蚪形、球形、和絲狀三種。從結(jié)構(gòu)看以可分為六種不同的類型。1、噬菌體的繁殖病毒粒子并無(wú)個(gè)體的生長(zhǎng)過(guò)程，而只有其兩種基本成分的合成和裝配，即： 核酸復(fù)制+蛋白質(zhì)合成核蛋白（病毒粒子）噬菌體的繁殖一般可分五個(gè)階段，即吸附 侵入增殖（復(fù)制與生物合成）成熟（裝配）裂解（釋放）尾絲尖端與宿主細(xì)胞表面的特異性受體接觸，可觸發(fā)尾絲散開(kāi)，附著在受體上，隨之把刺突、基板固定（1）吸附病毒吸附蛋白與細(xì)胞受體間的結(jié)合力來(lái)源于空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。（2）侵入吸附尾釘固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過(guò)中空的尾管壓入

6、胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；（3）增殖 病毒利用宿主的生物合成機(jī)構(gòu)和場(chǎng)所，使病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。（4）成熟（裝配）T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的指導(dǎo)裝配的過(guò)程（5）裂解（釋放）吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成2、噬菌體效價(jià)的測(cè)定效價(jià)表示每毫升試樣中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)又稱噬菌斑形成單位（pfu）或感染中心 測(cè)定的方法雙層平板法 用雙層平板法測(cè)出的效價(jià)比用電鏡直接記數(shù)得到的效價(jià)低。 前者是計(jì)有感染力的噬菌體粒子，后者是計(jì)噬菌體的總數(shù)。 一步生長(zhǎng)曲線可分為三個(gè)時(shí)期： 潛伏期是指菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第 一

7、個(gè)噬菌 體粒子裝配前的一段時(shí)間。 裂解期是指溶液中噬菌體粒子急劇增多的一 段時(shí)間。 穩(wěn)定期溶液中噬菌體總數(shù)達(dá)到最高點(diǎn)后的時(shí)期。3、一步生長(zhǎng)曲線定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱作一步生長(zhǎng)曲線4、溶 源性 溫和噬菌體或稱溶源性噬菌體（lysogenic phage）：感染宿主細(xì)胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長(zhǎng)期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，沒(méi)有成熟噬菌體產(chǎn)生。這一現(xiàn)象稱做溶源性（lysogeny）現(xiàn)象附著或融合在溶源性細(xì)菌染色體上的溫和噬菌體的核酸稱為原噬菌體或前噬菌體。前噬菌體含有溫和噬菌體的DNA 而又找不到形態(tài)上可見(jiàn)的噬菌體粒子的宿主細(xì)菌叫溶源性細(xì)菌。溶源性細(xì)菌的基本特性： 自發(fā)裂解 誘發(fā)裂解

8、 免疫性 復(fù)愈性 溶源轉(zhuǎn)變植物病毒沒(méi)有專門的吸附結(jié)構(gòu)，通過(guò)昆蟲(chóng)口器、摩擦傷口和人為傷口進(jìn)入寄主細(xì)胞。植物病毒在入住宿主細(xì)胞后脫去蛋白質(zhì)外殼。 TMV的衣殼粒以雙層盤的形式組裝成衣殼，PH的改變、RNA的嵌入對(duì)衣殼的裝配起關(guān)鍵作用。（二）植物病毒（三）人類和脊椎動(dòng)物病毒脊椎動(dòng)物病毒包括DNA和RNA病毒，動(dòng)物病毒的釋放方式多種多樣，主要有以下幾種形式：1.無(wú)包膜的病毒，如腺病毒通過(guò)細(xì)胞裂解或局部破裂而釋放。2.有包膜的DNA病毒，如皰疹病毒，以細(xì)胞質(zhì)中通道釋放到細(xì)胞外。3.有包膜的RNA病毒，如副流感病毒用出芽方式通過(guò)寄主細(xì)胞膜， 釋放到細(xì)胞外并獲得細(xì)胞源性的包膜和產(chǎn)生刺突。腺病毒的復(fù)制可代表D

9、NA病毒的復(fù)制脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制可代表RNA病毒的復(fù)制1.吸附：腺病毒吸附在宿主細(xì) 胞表面的糖蛋白受體上。2.穿入：通過(guò)吞噬作用進(jìn)入胞內(nèi)。3.脫殼：寄主細(xì)胞的蛋白酶 水解腺病毒衣殼。 4.在宿主細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄早期 mRNA并翻譯早期蛋白。5.在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制出病毒的 DNA和晚期mRNA。 一些帶有囊膜的病毒，如單純皰疹病毒，當(dāng)它們的核酸和衣殼蛋白組裝完畢后，它們將以“出芽”的方式，包裹寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜或核膜，從寄主細(xì)胞中釋放出來(lái)。 引起愛(ài)滋病的病毒人類免役缺陷病毒（HIV）從淋巴細(xì)胞中釋放出來(lái)（四）昆蟲(chóng)病毒多數(shù)昆蟲(chóng)病毒可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體，稱多角體，成分為堿溶性結(jié)晶蛋白

10、，其內(nèi)包裹著數(shù)目不等的病毒粒。核形多角體病毒（NPV）：在昆蟲(chóng)細(xì)胞核內(nèi)增殖、具有 蛋白質(zhì)包涵體的桿狀病毒 質(zhì)形多角體病毒（CPV）：在昆蟲(chóng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖、可形 成蛋白質(zhì)包涵體的球狀病毒 顆粒體病毒（GV）：具有蛋白質(zhì)包涵體，每個(gè)包涵體 內(nèi)通常僅含一個(gè)病毒粒的昆蟲(chóng)桿 狀病毒主要有三種類型：第二節(jié) 亞 病 毒1971年T.O.Diener闡明馬鈴薯紡錘形塊莖病毒的病原是一種具有感染性和自主復(fù)制能力的低分子RNA（類病毒，Diener,1971）以后又發(fā)現(xiàn)了稱之為擬病毒(Randles,1981)的植物病毒Prusiner發(fā)現(xiàn)了朊病毒(Prusiner,1982)。一、類病毒類病毒是裸露的，僅含一個(gè)單

11、鏈環(huán)狀低相對(duì)分子質(zhì)量RNA分子的病原體。 發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)類病毒是馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(Potato spindletuber viroid，PSTV)，這是一種導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)的病原體，棒狀，無(wú)蛋白外殼。它僅含一個(gè)由359個(gè)核苷酸組成的單鏈環(huán)狀RNA分子(相對(duì)分子質(zhì)量約100 000)。該分子內(nèi)有很多堿基(70)通過(guò)氫鍵配對(duì)而形成雙螺旋區(qū)，未配對(duì)堿基則形成內(nèi)環(huán)。雙螺旋區(qū)與內(nèi)環(huán)交替排列形成一個(gè)伸長(zhǎng)的棒狀分子。 類病毒RNA相對(duì)分子質(zhì)量雖小，但能獨(dú)立侵染寄主，侵入寄主后也能自我復(fù)制，不需要輔助病毒。二、擬病毒 一類被包裹在植物病毒粒體內(nèi)部的類病毒，被稱為擬病毒。擬病毒含有兩種RNA分子，一種和

12、一般病毒中的類似，另一種RNA分子與類病毒有相似的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，也是環(huán)狀的。不過(guò)這兩種RNA分子單獨(dú)都不表現(xiàn)致病性，只有聯(lián)合起來(lái)才具有復(fù)制和感染性。這種類似類病毒的RNA稱之?dāng)M病毒（Virusoid）。 又稱蛋白質(zhì)侵染因子。朊病毒是一類能侵染動(dòng)物并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小分子無(wú)免疫性疏水蛋白質(zhì)。羊瘙癢病是羊的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性紊亂疾病。表現(xiàn)為毛脫落，皮膚瘙癢，失去平衡和后肢麻痹等癥狀。這種“羊瘙癢病”的病原是經(jīng)過(guò)近兩個(gè)世紀(jì)的研究未能解決的一個(gè)謎。直至1982年，美國(guó)加洲大學(xué)舊金山分校動(dòng)物病毒學(xué)家SBPrusiner發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病是蛋白質(zhì)侵染引起的疾病，并稱為“Prion”即朊病毒。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)

13、與朊病毒有關(guān)的疾病有羊瘙癢病、貂腦病、人的庫(kù)魯病（震顫?。┖涂搜攀喜?。有人還推測(cè)人類的一些慢性退化性紊亂疾病，像早老年癡呆，帕金森氏病、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡等疾病也可能是由朊病毒引起的。三、朊病毒(prion) ：變態(tài)反應(yīng)(allergy ) 定義：抗原或半抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞性和體液性免疫反應(yīng)，當(dāng)二次抗原再進(jìn)來(lái)時(shí)發(fā)生了超敏反應(yīng)，引起組織損傷。 分類：1、根據(jù)反應(yīng)發(fā)生的快和慢來(lái)分：速發(fā)型，遲發(fā)型 2、1968年Gell和Coombs將變態(tài)反應(yīng)分為、。 第一節(jié) 型變態(tài)反應(yīng)（anaphylaxis） 一、動(dòng)物過(guò)敏性休克二、人類的型超敏反應(yīng)1、血清過(guò)敏性休克（serumanaphylaxi

14、s）舉例：注射破傷風(fēng)抗毒素（馬血清）癥狀：病人不安，注射局部腫脹，鼻喉發(fā)癢，呼吸困難，血壓下降，出冷汗，休克處理：一問(wèn)，二試，三注射脫敏目的：避免組胺一次大量釋放2、 藥物過(guò)敏性休克舉例：青霉素容易過(guò)敏的原因：1、遺傳因素，家族史2、日常生活中自然致敏3、注射器未洗滌干凈3、局部過(guò)敏反應(yīng)1、食物過(guò)敏2、花粉、香料3、動(dòng)物皮毛三、發(fā)病機(jī)理 型超敏反應(yīng)的介質(zhì)1、組織胺(histamin)生物學(xué)效應(yīng)：作用十分短暫。增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性，使支氣管及其平滑肌發(fā)生收縮，并刺激黏液腺分泌。2、白三烯(srs-a)：生物學(xué)效應(yīng)：作用慢而持久。平滑肌收縮，支氣管哮喘。3、激肽（kinin）生物學(xué)效應(yīng);刺激平滑肌收

15、縮，對(duì)人支氣管有很強(qiáng)的收縮作用，強(qiáng)烈的血管擴(kuò)張作用，血壓下降4、血小板活化因子（paf）生物學(xué)效應(yīng)：活化血小板使其釋放組織胺，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增加嗜酸性粒細(xì)胞趣化因子（ecf-a）生物學(xué)作用：吸引嗜酸性細(xì)胞向局部聚集的趨化作用。5、5羥色胺（5ht）生物學(xué)活性與組織胺相似6、前列腺素（pg）生物學(xué)活性:血管擴(kuò)張劑和支氣管收縮劑 小 結(jié)1、 發(fā)作快2、 抗體是IgG3、 無(wú)補(bǔ)體參加4、 反應(yīng)重，大多發(fā)生休克，出現(xiàn)全身或局部癥狀5、 和遺傳有關(guān)，個(gè)體有差異6、 可以用抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移第二節(jié) 型變態(tài)反應(yīng) 細(xì)胞毒型（cytotoxic type）一、特 點(diǎn)1、起因：由于中等大小可溶性免疫復(fù)合物沉積

16、2、致?。好庖邚?fù)合物沉積在血管基底膜上，激活補(bǔ)體，吸引中性粒細(xì)胞及血小板聚集，造成血管炎癥損傷。3、 抗體為IgG、IgM一、型變態(tài)反應(yīng)的特點(diǎn)1、抗原：機(jī)體細(xì)胞本身或藥物半抗原2、抗體：IgM,IgG3、補(bǔ)體參加4、被毒害的靶細(xì)胞：主要是血細(xì)胞，組織細(xì)胞5、結(jié)果：靶細(xì)胞融解，通過(guò)三條途徑：吞噬， ADCC,補(bǔ)體激活 二、分 類（一）自身成分成為自身抗原1、 輸血反應(yīng)2、 新生兒溶血母親為Rh()，第一胎是Rh()，第二胎是Rh()，導(dǎo)致溶血預(yù)防：第一胎分娩后72小時(shí)內(nèi)，給母親注射抗D-丙球蛋白產(chǎn)前診斷：孕婦血清中有無(wú)Rh抗體出生后診斷：有無(wú)黃疸、水腫、貧血（二）外源性抗原1、藥物半抗原常引起過(guò)

17、敏性血細(xì)胞減少癥非那西汀、對(duì)氨基水楊酸，青霉素，內(nèi)毒素：溶血性貧血奎尼丁、氯霉素、磺胺、安替比林、保泰松：粒細(xì)胞減少癥奎寧、奎尼丁、苯海拉明:血小板減少性紫癜2、 抗腎小球基底膜型鏈球菌感染后腎小球腎炎：A型溶血性鏈球菌與腎小球基底膜有共同抗原，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)三、發(fā)病機(jī)理第三節(jié) 型變態(tài)反應(yīng) 免疫復(fù)合物型（immune complex type allergic reaction） 4、 抗原抗體比例A 抗原抗體比例合適，凝聚為不溶性免疫復(fù)合物，易被吞噬，不引起損傷。B 可溶性免疫復(fù)合物，體積微小者，在體內(nèi)易通過(guò)血管壁滲出，易被血流沖走，無(wú)危害。C 抗原抗體比例不合適，形成中等大小體積者的抗原抗

18、體沉淀于血管壁，激活補(bǔ)體，吸引中性粒細(xì)胞，造成血管炎癥損傷。二、發(fā)病機(jī)理（表）三、相關(guān)疾病1、 血清病第一次大劑量注射異種動(dòng)物血清后，體內(nèi)第7天就產(chǎn)生IgG、IgM抗體,而異種動(dòng)物血清尚未完全清除，二者結(jié)合形成可溶性免疫復(fù)合物，隨血流嵌入腎小球基底膜，關(guān)節(jié)滑液中，皮下組織毛細(xì)血管中。激活補(bǔ)體，吸引白細(xì)胞與血小板聚集，釋放血管活性物質(zhì)和溶酶體酶，引起腎小球腎炎。2、鏈球菌感染后腎小球腎炎鏈球菌M蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，再次感染時(shí)，鏈球菌抗原與已形成的抗體形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球基底膜，激活補(bǔ)體。3、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢病毒感染，支原體侵犯關(guān)節(jié)滑液引起炎癥。IgG進(jìn)入關(guān)節(jié)與抗原形成復(fù)合物，被吞噬細(xì)胞

19、吞噬。水解酶損傷IgG,并釋放出細(xì)胞。變性的IgG刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。其中的IgM抗體即Rh因子。4、 Arthus現(xiàn)象局部的抗體多于抗原，形成中等大小的免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體，產(chǎn)生過(guò)敏毒素，引起水腫，最終形成壞死性血管炎而導(dǎo)致潰瘍。 第四節(jié) 型變態(tài)反應(yīng)（delayed type allergic）一、 特點(diǎn)1、發(fā)作慢：致敏的機(jī)體再次接觸抗原12小時(shí)才出現(xiàn)反應(yīng)，2472小時(shí)至高峰2、細(xì)胞主導(dǎo)：T細(xì)胞起作用，無(wú)抗體、補(bǔ)體參加3、病變特點(diǎn)：?jiǎn)魏思?xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的；炎癥病變 4、致敏的淋巴細(xì)胞釋放的淋巴因子是細(xì)胞免疫中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，淋巴因子一般是對(duì)機(jī)體有利的，但過(guò)強(qiáng)會(huì)損傷組織。 二、發(fā)

20、病機(jī)制 三、 相關(guān)疾病1、傳染病細(xì)菌：結(jié)核、傷寒、副傷寒病毒：腮腺炎、皰疹病毒、牛痘病毒真菌：白色念珠菌2、接觸性皮炎接觸的小分子化學(xué)物質(zhì)藥物、化妝品等和皮膚蛋白結(jié)合形成完全抗原致敏 青霉素皮試和結(jié)核菌素皮試的區(qū)別OT 青霉素 （馬血清）原理型變態(tài)反應(yīng)（遲發(fā)型）型變態(tài)反應(yīng)（速發(fā)型）材料菌體蛋白 1：2000/0.1cc200單位/0.1cc 青霉素（馬血清）20單位/0.1cc結(jié)果判讀時(shí)間24-72h20陽(yáng)性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)0.5cm紅腫、硬結(jié)（致敏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)）紅暈（境界不清，偽足狀，周邊發(fā)紅，中間發(fā)白，水腫）陽(yáng)性說(shuō)明有型變態(tài)反應(yīng)，有細(xì)胞免疫對(duì)青霉素過(guò)敏，不能使用陰性無(wú)細(xì)胞免疫，未感染過(guò)TB，接種卡

21、介苗對(duì)象第五節(jié) 變態(tài)反應(yīng)的防治原則 1、 詢問(wèn)病史（過(guò)去史、家族史、接觸史）、皮試 2、 尋找過(guò)敏源，避免接觸3、 穩(wěn)定細(xì)胞膜：色氨酸二鈉等4、 提高CAMP的藥物5、 抗組織胺：苯海拉明，撲爾敏6、 平喘解痙：麻黃素7、 降低毛細(xì)血管通透性：CaCl2，VC8、 鈣離子拮抗劑：異搏定、硝苯吡啶等第四章 病毒 第三節(jié) 病毒的干擾現(xiàn)象與干擾素 干擾現(xiàn)象：兩種病毒同時(shí)感染一個(gè)細(xì)胞，其中一種會(huì)抑制另一種病毒增殖的現(xiàn)象。干擾素定 義： 由病毒或其他IFN誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人或動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它具有抗病毒、抑制腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性種 類：種類產(chǎn)生細(xì)胞 抗病毒 抗腫瘤 免疫調(diào)節(jié) 人白細(xì)胞 強(qiáng) 弱

22、 弱 人成纖維細(xì)胞 強(qiáng) 弱 弱 T細(xì)胞 弱 強(qiáng) 強(qiáng)干擾素特性廣譜性、種的特異性、間接性；抑制細(xì)胞分裂、分化及成熟；活化巨噬細(xì)胞及抑制細(xì)胞內(nèi)寄生物IFN的誘生與抗病毒機(jī)理 IFN的誘生和作用示意圖 早期中斷病毒復(fù)制，阻止病毒擴(kuò)散分期接種疫苗，避免干擾現(xiàn)象干擾現(xiàn)象的意義： 干擾素的副作用1.流感樣綜合征：患者發(fā)熱、寒戰(zhàn)、全身不適，肌痛、頭痛等。 2.造血系統(tǒng)改變：抑制骨髓，降低外周血白細(xì)胞及血小板。3.消化系統(tǒng)反應(yīng)：如食欲不振、味覺(jué)異常、惡心、嘔吐、泄瀉、腹脹等。 4.皮膚反應(yīng)：用藥超過(guò)4個(gè)月者的最常見(jiàn)副作用是輕、中度脫發(fā)，偶有停藥后更嚴(yán)重者。 第四節(jié) 病毒的感染與免疫病毒的傳播方式一、水平傳播病

23、毒在人群不同個(gè)體間的傳播病毒侵入機(jī)體的重要門戶媒介昆蟲(chóng)叮咬感染呼吸道消化道動(dòng)物咬傷感染接觸感染登革熱常見(jiàn)的癥狀1、發(fā)熱所有患者均發(fā)熱。2、皮疹于病程25日出現(xiàn)，初見(jiàn)掌心、腳底或軀干及腹部，漸延及頸部及四肢。3、出血于發(fā)病后5-8日，2550%病例有不同部位、不同程度的出血。 4、淋巴結(jié)腫大全身淋巴結(jié)可有輕度腫大及觸痛。 5、其他可有肝臟腫大，脾大不常見(jiàn)，ALT升高 二、垂直傳播通過(guò)胎盤或產(chǎn)道，病毒由母親傳給胎兒的方式胎盤流產(chǎn)病毒感染的播散方式1 局部播散2 經(jīng)淋巴和血流播散3 經(jīng)神經(jīng)通道播散病毒的致病機(jī)理一、病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接作用 細(xì)胞水平上致病機(jī)理1、殺細(xì)胞性感染：多見(jiàn)于無(wú)包膜病毒 2、穩(wěn)

24、定狀態(tài)感染：多見(jiàn)于有包膜病毒 3、整合感染：多見(jiàn)于腫瘤病毒4、細(xì)胞凋亡5、細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)化 二、病毒感染的免疫病理作用 機(jī)體水平上致病機(jī)理1、體液免疫的病理作用2、細(xì)胞免疫的病理作用3、免疫系統(tǒng)的功能被抑制感染的類型向外播散病毒 機(jī)體獲得特異性免疫急性感染 持續(xù)性感染 隱性感染顯性感染慢性感染： 病程長(zhǎng) 病毒可檢出 如HBV潛伏感染：經(jīng)感染后，病毒基因存在于組織細(xì)胞中，可反復(fù)激活，急性發(fā)作病毒只有在急性發(fā)作時(shí)才被檢出如 HSV、ZVZ慢發(fā)病毒感染：潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病后為亞急性進(jìn)行性直至死亡尋常病毒非尋常病毒 持續(xù)性感染 第五節(jié)噬菌體噬菌體（bacteriophage , phage） 是感染細(xì)菌、

25、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的 病毒 具有病毒的特性：個(gè)體微小，可以通過(guò)細(xì)菌濾器，電鏡觀察沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸組成專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物噬菌體噬菌體與宿主菌的關(guān)系 宿主細(xì)胞溶解（溶菌反應(yīng)） 兩種結(jié)局 宿主細(xì)胞呈溶原狀態(tài)（溶原性反應(yīng)） 毒性噬菌體 溶菌反應(yīng) 兩種噬菌體 溶菌反應(yīng) 溫和噬菌體 溶原性反應(yīng)毒性噬菌體（virulent phage） 概念：能在宿主菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體， 并最終裂解細(xì)菌的噬菌體。完成溶菌周期復(fù)制周期： 吸附 穿入 生物合成 組裝與釋放 毒性噬菌體復(fù)制周期噬菌現(xiàn)象液體培養(yǎng)基 混濁 澄清固體培養(yǎng)基中，出現(xiàn)噬斑（plaque）溫和噬菌體（temp

26、erate phage） 概念： 噬菌體基因與宿主菌染色體整合，不產(chǎn)生子代 噬菌 體，但噬菌體DNA能隨細(xì)菌DNA復(fù)制，并隨細(xì)菌的分 裂而傳代。該種狀態(tài)稱溶原狀態(tài)。該噬菌體稱 溫和噬 菌體。 前噬菌體（prophage）：整合在細(xì)菌基因組中的噬菌體基因 溶原性細(xì)菌（lysogenic bacterium）：帶有前噬菌體基因的 細(xì)菌 完成溶原周期, 誘導(dǎo)條件下完成溶菌周期溶原性轉(zhuǎn)換 某些前噬菌體可導(dǎo)致細(xì)菌基因型和性狀發(fā)生改變?nèi)茉灾芷诤腿芫灾芷?發(fā)生整合的噬菌體基因可隨細(xì)菌基因的噬菌體基因傳給子代細(xì)菌，該過(guò)程稱之為噬菌體的溶原性周期。在一定條件下，細(xì)菌的溶原狀態(tài)可自發(fā)停止，噬菌體進(jìn)入溶菌周期，

27、產(chǎn)生許多子代噬菌體，導(dǎo)致細(xì)菌裂解，稱為溶菌性周期。溫和噬菌體有溶原性周期和溶菌周期 毒性噬菌體則只有一個(gè)溶菌性周期溶原性細(xì)菌具有的特征 該菌的某些生物學(xué)性狀發(fā)生改變 例： 帶有-棒狀桿菌噬菌體的白喉棒狀桿菌 產(chǎn)生 白喉外毒素 噬菌體的應(yīng)用細(xì)菌的鑒定與分型分子生物學(xué)研究的重要工具作為局部感染的輔助治療研究病毒的意義 1.噬菌體可以作為防治某些疾病的特效藥，例如燒傷病人在患處涂抹綠膿桿菌噬菌體稀釋液 2.在細(xì)胞工程中，某些病毒可以作為細(xì)胞融合的助融劑，例如仙臺(tái)病毒 3.在基因工程中，病毒可以作為目的基因的載體，使之被拼接在目標(biāo)細(xì)胞的染色體上 4.在專一的細(xì)菌培養(yǎng)基中添加的病毒可以除雜 5病毒可以作

28、為精確制導(dǎo)藥物的載體 6病毒可以作為特效殺蟲(chóng)劑 7病毒還在生物圈的物質(zhì)循環(huán)和能量交流中起到關(guān)鍵作用 8病毒還可以用來(lái)治療疾病，比如癌癥 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)趙健喬一 基本原理二 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念三 主要優(yōu)點(diǎn)四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)一 基本原理通過(guò)機(jī)械解離或消化等方法將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給與必要的生長(zhǎng)條件。模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長(zhǎng)與增值。在長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞后，將病毒接種在細(xì)胞上，置于適當(dāng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）待75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，置-70保存?zhèn)溆谩＜?xì)

29、胞培養(yǎng)的基本概念傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。二 主要優(yōu)點(diǎn) 研究的對(duì)象是活的細(xì)胞。 研究的條件可以人為的控制。 研究的樣本，可以達(dá)到比較均一性。 研究的內(nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄。 研究的范圍比較廣泛。 研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì)。三 分類原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)概念：從供體獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，細(xì)胞染色體仍為二倍體，接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適合做藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)：傳代次數(shù)較多細(xì)胞就會(huì)衰亡。傳代細(xì)胞培養(yǎng)概念：原

30、代細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列傳代，產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)化為能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞。傳代細(xì)胞可以直接從腫瘤組織獲得，又可以通過(guò)人工馴化獲得。常用的傳代細(xì)胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等 四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿2.包裝3.消毒：在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)胞在無(wú)微生物的條件下生長(zhǎng)。4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）: （1）水：蒸餾水、雙蒸水，可高壓除菌。（2）平衡鹽溶液（PBS)：PH為7.27.4，不含鈣鎂離子 ， 可高壓除菌。（3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為025，pH值7.2

31、左右。需過(guò)濾除菌。 EDTA液：常用濃度為 002，配制時(shí)采用無(wú)Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。 (4) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)

32、機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10血清對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、

33、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘（5）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細(xì)胞生命的能量來(lái)源。（6）抗生素：最終濃度為青霉素 100 Uml，鏈霉素100Uml（青霉素為80萬(wàn)U瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5ml；鏈霉素為100萬(wàn)U瓶，將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。（7）凍存液：二甲基亞砜（8）細(xì)胞生長(zhǎng)液：是用以維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的液體。其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8090 血清 10% 雙抗 100u/ml （9）細(xì)胞維持液：用以維持細(xì)

34、胞緩慢生長(zhǎng)或不死的培養(yǎng)液。其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 95 血清 25 雙抗 100u/ml 五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞 必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。 懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟1原代細(xì)胞的培養(yǎng) 以雞胚成纖維細(xì)胞為例 （1）取胚 （2）組織處理 （3）消化 （4）分裝、培養(yǎng)（1）取胚選取9-11日齡SPF雞胚，

35、大頭朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒氣室外殼。用鑷子從氣室端打開(kāi)蛋殼，撕開(kāi)殼膜，用無(wú)菌鑷子輕輕取出雞胚，放入滅菌平皿中。（2）組織處理用PBS液沖洗胚體2-3次，再將雞胚的頭、爪、內(nèi)臟去除，剩下的胚體在用PBS液沖洗胚體2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀將雞胚剪成碎塊。（3）消化用PBS液充分沖洗組織碎塊2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分鐘，每隔2-3分鐘輕輕搖動(dòng)一次。待組織碎塊聚合成團(tuán)，邊緣毛樣模糊時(shí)取出，輕輕吸取上層消化液，加適量DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散。（4）分裝、培養(yǎng)將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入到10ml DMEM，充分混勻

36、，讓細(xì)胞呈單個(gè)形式存在，最后將其放入恒溫箱中培養(yǎng)。2傳代細(xì)胞的培養(yǎng)（1）細(xì)胞的復(fù)蘇（2）細(xì)胞的傳代（3）細(xì)胞的換液（4）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察（5）細(xì)胞的凍存（1）細(xì)胞的復(fù)蘇概述 復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。操作步驟 準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺(tái)內(nèi)。 從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的凍存管（安瓶）應(yīng)直接投入37溫水中，并輕輕搖動(dòng)令其內(nèi)容盡快融化。 從37水浴中取出凍存管或安瓶，離心1000r1min,用酒精消毒后開(kāi)啟，用滴管吸出上清

37、液，注入培養(yǎng)液1ml充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離心管制成細(xì)胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時(shí)再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞密度較高要及時(shí)傳代。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞數(shù)可以做1020倍稀釋，接種密度以5105 ml為宜。（2）細(xì)胞的傳代原理 在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。操作步驟

38、 將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。 用1-2ml營(yíng)養(yǎng)液或PBS緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，當(dāng)看到培養(yǎng)瓶上含有一兩個(gè)小空斑，也可看到有灰白色渾濁時(shí)，將胰酶倒掉 加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細(xì)胞的一面，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來(lái) 然后進(jìn)行傳代消化傳代的步驟（3）細(xì)胞的換液原理： 當(dāng)細(xì)胞的量很少，未能鋪滿整個(gè)生長(zhǎng)表面，但細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)發(fā)生很大變化；或者是細(xì)胞形態(tài)很差等情況時(shí)，需要給細(xì)胞換液。操作步驟 （1）吸棄或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液 （2）加入PBS溶液清洗細(xì)胞瓶五面 （3）加入足量的細(xì)胞生長(zhǎng)液，放入37、5%

39、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。（4）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察原理： 應(yīng)每日或隔日觀察一次細(xì)胞，及時(shí)了解細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及培養(yǎng)液pH值、污染與否等情況，以便采取相應(yīng)的措施處理。 肉眼觀察 顯微鏡觀察（5）細(xì)胞的凍存?zhèn)鞔?xì)胞應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備。一則防止細(xì)胞因污染等原因造成細(xì)胞系的絕種。二則防止細(xì)胞因傳的代次太多，造成細(xì)胞衰老或細(xì)胞發(fā)生變異。細(xì)胞凍存方法（1）選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用常規(guī)傳代的方法將細(xì)胞制成懸液并計(jì)數(shù)，800-1000r/min離心5min，棄上清。（2）用細(xì)胞凍存液將沉淀重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至106-107個(gè)/ml，分裝于凍存管，注明細(xì)胞名稱，傳代及凍存日期。（3）冷凍保存：將凍存管于4放置30mi

40、n，然后移入-80超低溫冰箱過(guò)夜，再放入液氮罐長(zhǎng)期保存。亦可使用程序降溫劑逐漸降溫，凍存速度先為每分鐘下降速度1-2，當(dāng)溫度達(dá)到-25時(shí)，可調(diào)整下降速度為每分鐘5-10，溫度降至-100時(shí)，再放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)以禽流感感染雞胚成纖維細(xì)胞為例。（1）病料的處理（2）病毒分離、繁殖（3）細(xì)胞病變的觀察（4）效價(jià)測(cè)定（5）中和實(shí)驗(yàn)（1）病料的處理 采集疑是感染禽流感禽的心、腦、肺、淋巴結(jié)在含有雙抗的PBS液中研磨，4過(guò)夜，3000r/min離心10min，上清通過(guò)0.22m抽濾（2）病毒分離、繁殖1 將病毒液稀釋成多個(gè)濃度分別接種在雞胚中，雞胚死亡后收集尿囊液。取效價(jià)最高的尿囊

41、液接種細(xì)胞。2 將長(zhǎng)成單層致密的雞胚成纖維細(xì)胞液倒掉，用PBS反復(fù)清洗3次，將死亡或脫落的細(xì)胞洗掉3 取0.5ml處理好的禽流感病毒液注入細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，使病毒液充分鋪滿瓶底4 將接種病毒后的細(xì)胞瓶置于培養(yǎng)箱中感作45 min，將感作后的細(xì)胞瓶補(bǔ)加4.5ml營(yíng)養(yǎng)液后置于溫箱中培養(yǎng)5 12h后觀察細(xì)胞病變，若無(wú)明顯病變，則每隔3h觀察一次。當(dāng)有70%細(xì)胞發(fā)生病變后，將細(xì)胞液反復(fù)凍融3次，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次，使病毒完全從細(xì)胞中釋放出來(lái) 正常形態(tài)的雞胚成纖維細(xì)胞接毒后發(fā)生病變的雞胚成纖維細(xì)胞（4）效價(jià)測(cè)定 某些病毒具有凝集某種哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的特性，利用該特性而進(jìn)行的試驗(yàn)稱為病毒的血凝試驗(yàn)。病毒增殖技術(shù) 動(dòng)

42、物增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)細(xì)胞增殖病毒技術(shù)一、動(dòng)物增殖病毒技術(shù) 選擇動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)：大動(dòng)物應(yīng)來(lái)源于非疫區(qū)，最好是未接種過(guò)相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)；對(duì)相應(yīng)病毒易感，并十分敏感；經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康；家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級(jí)或清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；體重、年齡要基本一致，個(gè)體差別不宜過(guò)大。 二、禽胚增殖病毒技術(shù)（一）禽胚的選擇 SPF雞胚 據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)22種特定病原體 非免疫雞胚 應(yīng)無(wú)特定病原的母源抗體， 普通雞胚 可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn) 異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚（二）禽胚

43、接種途徑與收獲 絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 卵黃囊接種法 羊膜腔接種法 靜脈接種法 腦內(nèi)接種法雞胚絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 尿囊液收獲方法 雞胚卵黃囊接種法1種蛋質(zhì)量病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病毒、支原體及傳染性貧血因子等。母源抗體：抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體 2孵化技術(shù)溫度：3739.5。傳染性支氣管炎病毒37 濕度：雞胚5357，水禽胚比雞胚高510。通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。 翻蛋：（三）影響禽胚增殖病毒的因素3接種技術(shù) 不同病毒的增殖有不同的接種途徑， 同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。接種日齡：雞胚1314日齡。鴨胚1516日齡，尿囊液含 量

44、最高，平均約68ml，羊水約12ml。接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育嚴(yán)格防止禽胚污染 雞胚接種時(shí)嚴(yán)格無(wú)菌操作； 定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮； 種蛋入孵前先用溫水清洗，消毒，涼干。三、細(xì)胞增殖病毒技術(shù) 1細(xì)胞培養(yǎng)的概念 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞分類：根據(jù)細(xì)胞染色體和繁殖特性 原代細(xì)胞(primary cell) 細(xì)胞株(cell strain) 傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系(cell line)（1）原代細(xì)胞(primary cell) 指由

45、新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞。（2）細(xì)胞株(cell strain) 又稱二倍體細(xì)胞 指自繼代培養(yǎng)的細(xì)胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞。這類細(xì)胞且能保持原來(lái)的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代(50100代)，但為有限生命；沒(méi)有腫瘤原。如PKl5、BHK21和Vero （3）傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系(cell line) 能在體外無(wú)限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細(xì)胞，且多來(lái)源于癌細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞系 靜置培養(yǎng) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(suspension cell culture ) 微載體培養(yǎng)(microcarr

46、ier cell culture) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 微囊化細(xì)胞培養(yǎng)2細(xì)胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng) 通過(guò)振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 微載體培養(yǎng)微載體直徑應(yīng)為60105nm，無(wú)毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細(xì)胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動(dòng)

47、化裝置。細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)106107個(gè)/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體25g，每克有80009000個(gè)珠子，培養(yǎng)面積約為25萬(wàn)cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大1025倍。 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50100m，壁厚2575m，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。培養(yǎng)液能有效地分布，細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間可達(dá)數(shù)月，保持高度活性，培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞

48、分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達(dá)6090；占用空間小，適于各類細(xì)胞，但設(shè)備昂貴。 培養(yǎng)液血清細(xì)胞接種量pH溫度無(wú)菌條件培養(yǎng)器皿清潔度3. 細(xì)胞培養(yǎng)要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 血清成分：必需氨基酸、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁的成分。-珠蛋白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和脂蛋白G2能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。血清選擇：同種動(dòng)物優(yōu)于異種動(dòng)物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。血清使用：目前國(guó)內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56滅活30min，并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。生長(zhǎng)液血清含量一般為520。維持液中血清量為0%5。血清替代因子：激素和生長(zhǎng)因子（如胰島素、上皮

49、生長(zhǎng)因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚(yú)精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)液須補(bǔ)加38種血清替代因子。細(xì)胞接種量 細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長(zhǎng)為單層的速度越快，但細(xì)胞過(guò)多對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也不利。雞胚成纖維細(xì)胞為100萬(wàn)m1小鼠或地鼠腎細(xì)胞為50萬(wàn)m1猴腎細(xì)胞量為30萬(wàn)ml傳代細(xì)胞為1030萬(wàn)m1(1) 細(xì)菌污染(2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培養(yǎng)液中可見(jiàn)黃白色小點(diǎn)狀懸浮物 鏡檢時(shí)可見(jiàn)菌絲結(jié)構(gòu)。 (3) 支原體污染：污染率為5060(4) 病毒污染 組織帶毒 培養(yǎng)液帶毒4細(xì)胞培養(yǎng)

50、污染問(wèn)題（1）血清 ：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過(guò)2。（2）溫度：狂犬病病毒32，犬皰疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接種劑量：應(yīng)以TCID50為依據(jù) 一般按維持液的110(VV)量接入。 接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會(huì)影響毒價(jià)； 接種量過(guò)大，會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。5. 細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素6. 病毒增殖指標(biāo)與收獲細(xì)胞病變(CPE)：細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細(xì)胞聚合，如腺病毒；細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；輕微病變，如正粘病毒、冠狀病毒等。包涵體和血凝性：也可作為檢查病毒增殖的指標(biāo)。 有些病毒不產(chǎn)生CPE。病毒收獲：C

51、PE達(dá)80時(shí)收獲，反復(fù)凍融多次使病毒釋放， 然后離心除去細(xì)胞碎片，上清病毒液-20保存。病毒毒價(jià)：TCID50、中和試驗(yàn)、AGP效價(jià)、HA疫苗制造工藝流程病毒性細(xì)胞疫苗制造工藝流程 病毒性組織疫苗制造工藝流程細(xì)菌疫苗和類毒素制造工藝流程 寄生蟲(chóng)疫苗制備的工藝流程 常見(jiàn)致病病毒（一）呼吸道病毒呼吸道病毒的定義 指侵犯呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)和/或呼吸系統(tǒng)外組織器官病變的病毒呼吸道病毒的種類及引起疾病核酸類型 病毒 科別 引起疾病RNA 流感病毒 正粘病毒 流行性感冒 副流感病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 呼吸道合胞病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 麻疹病毒 副粘病毒 麻疹 腮腺炎病毒 副粘

52、病毒 流行性腮腺炎 鼻病毒 副粘病毒 感冒、支氣管炎 風(fēng)疹病毒 披蓋病毒 風(fēng)疹 人冠狀病毒 冠狀病毒 感冒、咽炎DNA 人腺病毒 腺病毒 感冒、支氣管炎、肺炎 結(jié)膜炎、咽炎、扁桃腺炎流行性感冒病毒流感病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、培養(yǎng)特性三、抗原結(jié)構(gòu)四、抵抗力五、分型形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：球形、有包膜、核衣殼螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)：核衣殼：核酸（單負(fù)鏈RNA、分節(jié)段） 核蛋白（NP） RNA多聚酶（PA、PB1、PB2）包膜：基質(zhì)蛋白M1、M2 （內(nèi)層） 鑲嵌蛋白HA、NA（外層）甲型流感病毒結(jié)構(gòu)模式HANAM1M2PB2PB1PANPRNAHANA甲型流感病毒(電鏡）甲型流感病毒(新分離株）流感病毒神經(jīng)

53、氨酸酶培養(yǎng)特性1、雞胚接種：羊膜腔、尿囊2、細(xì)胞培養(yǎng)：猴腎原代、狗腎傳代 感染細(xì)胞無(wú)明顯病變，須以紅細(xì)胞吸附、凝集 試驗(yàn)證實(shí)抗原結(jié)構(gòu)1、核蛋白：穩(wěn)定、具型特異性2、內(nèi)膜基質(zhì)蛋白：穩(wěn)定、具型特異性3、HA、NA：甲型流感病毒易變異、構(gòu)成亞型 抗原漂移（antigenic drift） 抗原轉(zhuǎn)換（antigenic shift）甲型流感抗原轉(zhuǎn)換與疾病流行流行年代 亞型類別 代表株 1918 Hsw1N1 1947 H1N1（亞甲型） A/FM/1/47 1957 H2N2（亞洲甲型） A/Singapore/1/57 1968 H3N2（香港甲型） A/HongKong/1/68 1977 H1N

54、1（新甲1型） A/USSR/90/77抵抗力1、弱、不耐熱、56 30min殺滅 （-70 長(zhǎng)期保存）2、對(duì)干燥、紫外線、乙醚、甲醛、 乳酸敏感分型 甲型 乙型 丙型疾病嚴(yán)重程度 + + +動(dòng)物儲(chǔ)毒 + 引起大流行 + 引起傳播 + + 抗原調(diào)變 漂移、轉(zhuǎn)換 漂移 漂移RNA節(jié)段 + + +一、傳播方式二、所致疾病三、致病機(jī)制四、免疫性流感病毒的致病性傳播方式侵襲呼吸道上皮細(xì)胞增殖引起細(xì)胞空泡變性壞死脫落所致疾病飛沫傳播致病機(jī)制流感、肺炎、Reyes綜合征免疫性1、細(xì)胞免疫：存在廣泛的亞型間交叉反應(yīng)2、體液免疫：同型病毒可形成牢固免疫力 亞型間無(wú)交叉反應(yīng)流感病毒感染的診斷與防治一、微生物學(xué)檢

55、查二、防治 標(biāo)本類型：咽嗽液、鼻咽拭檢測(cè)方法：病毒分離：雞胚接種、細(xì)胞培養(yǎng) 血清學(xué)診斷：血凝抑制試驗(yàn) 病毒核酸測(cè)定：PCR微生物學(xué)檢查防治疫苗：三價(jià)滅活疫苗治療：抗病毒劑、中草藥腸道病毒腸道病毒的分類關(guān)系小RNA病毒科腸道病毒屬鼻病毒屬脊髓灰質(zhì)炎病毒柯薩奇病毒埃可病毒新腸道病毒甲型肝炎病毒腸道病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、抵抗力形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：球形、無(wú)包膜、 核衣殼20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)：核酸單正鏈RNA、不分節(jié)段 多蛋白水解為4個(gè)（VP1-VP4） VP1-VP3衣殼蛋白 VP4核蛋白脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)模式VP1VP2VP3抵抗力1、強(qiáng)、耐酸、耐脂溶劑2、熱、紫外線敏感腸道病毒的分型脊髓灰

56、質(zhì)炎病毒 1、2、3型柯薩奇病毒A組 1-22、24型柯薩奇病毒B組 1-6型?？刹《?1-9、11-27、29-33型新腸道病毒 68、69、70、71、72* 甲型肝炎病毒腸道病毒的致病性疾病 柯薩奇A組病毒 柯薩奇B組病毒 ?？刹《?新腸道病毒類脊髓灰質(zhì)炎 7、9型 2-5型 2、4、6、9、11、30型 71型病毒性腦炎 2、4、7、9、10型 1-5型 4、6、9、11、16、30型 70、71型心肌、心包炎 4、16型 2-5型 2-6、9、11、16、18、25型呼吸道感染 9、16、21、24型 1、3-5型 4、9、11、20、25型 68型消化道感染 1、2型 1-3、6-

57、7、11-12、18-19型流行性結(jié)膜炎 24型 1、5型 7型 70型皰疹性咽峽炎 2、4-6、8、10、16型手足口病 2、6、8、10、16型肝炎病毒肝炎病毒的定義 指以侵犯人類肝細(xì)胞為主，只引起肝炎的病毒肝炎病毒的類型病毒 病毒科 核酸類型 傳播方式HAV 小RNA病毒 正單鏈RNA 糞-口HBV 嗜肝DNA病毒 雙鏈DNA 輸血HCV 黃病毒 正單鏈RNA 輸血HDV 負(fù)單鏈RNA 輸血HEV 杯狀病毒 正單鏈RNA 糞-口HFV 糞-口HGV 黃病毒 正單鏈RNA 輸血TTV 細(xì)小病毒 負(fù)單鏈DNA 輸血肝炎病毒的傳播方式1、糞-口：HAV、HEV、HFV（流行性）2、輸血、垂直：

58、HBV、HCV、HDV、 HGV、TTV（散發(fā)性）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒的生物學(xué)特性一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)二、培養(yǎng)特性三、抵抗力四、抗原結(jié)構(gòu)乙型肝炎病毒的三種顆粒小球型顆粒管型顆粒Dane 顆粒乙型肝炎病毒（電鏡）Dane 顆粒三種顆粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)1、形態(tài)：大球形顆粒Dane顆粒 小球型顆粒無(wú)核酸及DNA多聚酶 管型顆粒同小球型顆粒2、結(jié)構(gòu)：核酸雙鏈DNA、長(zhǎng)（負(fù)）鏈、短（正）鏈 S區(qū)：編碼preS1、preS2、HBsAg C區(qū)：編碼preC、HBcAg X區(qū)：編碼HBxAg（調(diào)控蛋白） P區(qū)：編碼DNA多聚酶 蛋白：衣殼HBcAg組成 包膜含大分子、中分子、小分子三種蛋白C 區(qū)X 區(qū)S 區(qū)P 區(qū)乙

59、型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)模式正鏈負(fù)鏈重復(fù)序列乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)模式大分子膜蛋白中分子膜蛋白小分子膜蛋白培養(yǎng)特性1、動(dòng)物接種：黑猩猩2、細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌傳代 抵抗力1、100。C 10min、0.5%過(guò)氧乙酸滅活2、耐干燥、紫外線、低溫抗原結(jié)構(gòu)1、HBsAg：共同決定簇a 型特異決定簇 d/y w/r 四種亞型：adr、adw、ayw、ayr2、 HBcAg：衣殼抗原3、 HBeAg： 分e1、e2、e3乙型肝炎病毒的致病性與免疫性一、傳播方式二、所致疾病三、致病機(jī)制四、免疫性傳播方式1、輸血傳播2、性接觸傳播3、垂直傳播4、口-口傳播（唾液檢測(cè)HBV-DNA）致病機(jī)制病毒直接損傷感染后免疫損傷整合感染所

60、致疾病急性肝炎爆發(fā)型肝炎慢性肝炎免疫性1、保護(hù)性免疫 抗HBsAg抗體主要中和抗體 針對(duì)HBeAg的細(xì)胞免疫是清除病毒的主要機(jī)制2、免疫損傷 針對(duì)HBsAg、 HBcAg、 HBeAg的細(xì)胞免疫造成肝細(xì)胞損傷 抗HBsAg抗體可致免疫復(fù)合物損傷乙型肝炎病毒感染的診斷與防治一、微生物學(xué)檢查二、防治 標(biāo)本類型：血清檢測(cè)方法：血清學(xué)診斷：“兩對(duì)半”測(cè)定 病毒核酸測(cè)定微生物學(xué)檢查HBV抗原、抗體的形成及意義0 1 2 3 4 5 6 7 8 （月）窗口期HBsAgHBeAgAnti-HBsAnti-HBeAnti-HBc潛伏期急性期恢復(fù)早期恢復(fù)晚期HBV抗原、抗體檢測(cè)的臨床意義HBsAg HBeAg