3第3章免疫原和抗血清的制備多媒體

1、第三章 免疫原和抗血清的制備第一節(jié) 免疫原的制備 一、顆粒性抗原的制備 二、可溶性抗原的制備和純化 三、半抗原性免疫原的制備第二節(jié) 免疫佐劑 一、佐劑的種類 二、佐劑的作用機(jī)制第三節(jié) 抗血清的制備 一、免疫動(dòng)物的選擇 二、免疫程序 三、動(dòng)物采血法第四節(jié) 抗血清的鑒定和保管 一、抗血清的鑒定 二、抗血清的保管第五節(jié) 抗血清的純化 一、特異性IgG抗體 二、單價(jià)特異性抗血清思索題小結(jié)根本要求：掌握：免疫原、抗血清的制備過(guò)程。掌握：抗血清的鑒定方法、抗血清的純化方法 抗原抗體是免疫學(xué)檢測(cè)的重要要素?？乖兓侵苽涮禺愋钥贵w的先決條件。制備高效價(jià)高特異性的抗血清必需有理想的免疫原。經(jīng)過(guò)抗血清的制備而獲

2、得特異性的抗體可用于純化抗原和檢測(cè)或鑒定抗原。抗體有來(lái)自單克隆抗體、免疫動(dòng)物的多克隆抗體和基因工程的抗體。第一節(jié) 免疫原的制備 免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能在體內(nèi)外與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反響的物質(zhì)。顆粒性抗原細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲可溶性抗原蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞 細(xì)菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原 寄生蟲體抗原：蟲卵一、顆粒性抗原的制備顆粒性抗原的制備 顆粒性抗原包括人和各種動(dòng)物細(xì)胞抗原以及各種細(xì)菌抗原和寄生蟲體抗原。 細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞普通情況下經(jīng)生理鹽水洗凈，配制一定濃度的細(xì)胞懸液，即可運(yùn)用。免疫原的制備細(xì)菌抗原多用液體或固

3、體培育物，經(jīng)集菌后處置。鞭毛抗原需用03%05%的甲醛處置；菌體抗原加溫100225h去除鞭毛抗原；毒素抗原那么在殺菌后再加05%10%氯化鈣溶液等。顆?？乖蠖嘤渺o脈內(nèi)注射免疫法，較少加佐劑作皮內(nèi)注射。蛋白質(zhì)、糖蛋白、細(xì)菌毒素、酶、補(bǔ)體和核酸都是良好的可溶性抗原。這些蛋白質(zhì)多為復(fù)雜的蛋白組成，免疫前需進(jìn)展純化。二、可溶性抗原的制備和純化組織細(xì)胞抗原的制備： 高速搗碎法組織搗碎機(jī)搗碎 研磨法用玻璃勻漿器或乳缽研磨 一 二、可溶性抗原的制備和純化高速組織搗碎機(jī)法：將組織加鹽水裝入搗碎機(jī)筒內(nèi)，延續(xù)進(jìn)展離心，每次30到6 0分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)熱。研磨法：用玻璃均漿器或乳缽研磨，經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)、壓擠將組

4、織粉碎。組織均漿液要離心沉淀，沉淀物組織和細(xì)胞碎片，上清液為提取可溶性抗原的資料。二、可溶性抗原的制備和純化組織細(xì)胞或培育細(xì)胞可溶性抗原的制備制備抗原的細(xì)胞包括正常的細(xì)胞、傳代細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞抗原普通分為三個(gè)部分：膜蛋白抗原、細(xì)胞質(zhì)抗原細(xì)胞器和細(xì)胞核與核膜抗原。二、可溶性抗原的制備和純化 組織細(xì)胞或培育細(xì)胞可溶性抗原的制備： 反復(fù)凍融法-20凍結(jié)，然后室溫融化 超聲破碎法超聲波120kHz 自溶法本身酶系 酶處置法溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶 外表活性劑處置法SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基溴 反復(fù)冷凍法：將細(xì)胞或整塊組織置-20冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后置室溫融化，如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞

5、內(nèi)的顆?？蓛鋈谄扑椤３暺扑榉ǎ豪贸暡C(jī)械振動(dòng)的原理使細(xì)胞破碎。常用于處置微生物和組織的細(xì)胞。自溶法：利用組織和微生物的本身酶系統(tǒng)，在一定PH和溫度下，使其細(xì)胞裂解。酶處置法：溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶等，在一定的條件下能消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。外表活性劑處置法：常用十二烷基硫酸鈉等外表活性劑處置。超速離心法： 差速離心法低速和高速離心交替進(jìn)展 密度梯度離心法區(qū)帶離心法 二可溶性抗原的純化超速離心分別法常用于分別亞細(xì)胞成分及大分子蛋白。差速離心法：用于分別大小差別較大的抗原顆粒梯度密度離心法：區(qū)帶分別法，經(jīng)過(guò)梯度密度離心，使各類分子量的顆粒分別。梯度柱。選擇性沉淀法： 核酸去除法氯化錳、硫酸魚精

6、蛋白、鏈霉素 鹽析法硫酸銨、硫酸鈉 有機(jī)溶劑沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇 選擇沉淀法采用各種沉淀劑或某些條件促使抗原成分沉淀的方法。核酸去除法：可采用氯化錳、硫酸魚精蛋白等核酸提取沉淀劑，而核糖核酸降解法更簡(jiǎn)單采用DNA或RNA酶有機(jī)溶劑沉淀法：運(yùn)用的有機(jī)溶劑多為乙醇或丙酮。選擇沉淀法鹽析沉淀法 經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分別技術(shù) 抗原的初篩：用不同飽和度的硫酸鈉或硫酸銨使蛋白抗原進(jìn)展初篩。提取丙種球蛋白:IgG95%以上將33%50%飽和度硫酸胺沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于抗體試劑?？乖臐饪s：經(jīng)過(guò)參與硫酸銨，將其沉淀下來(lái)，以利于進(jìn)一步純化。離子交換層析法： 利用蛋白質(zhì)帶電荷不同進(jìn)展分別 離子交

7、換劑： 離子交換纖維素、離子交換凝膠、離子交換樹(shù)脂 凝膠過(guò)濾法： 利用凝膠的分子篩作用，對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)展分別 凝膠過(guò)濾分子篩層析，具有三維空間 多孔網(wǎng)狀構(gòu)造的物質(zhì)。將含多種分子量的樣品溶液 緩慢流經(jīng)凝膠柱時(shí)，各分子 在柱內(nèi)進(jìn)展兩種不同運(yùn)動(dòng)， 垂直向下挪動(dòng)和無(wú)定向分散運(yùn)動(dòng)。經(jīng)過(guò)凝膠分子篩作用，大、中、 小三類分子彼此較易分開(kāi)。離子交換層析離子交換層析是利用一些帶電離子集團(tuán)的凝膠或纖維素，吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。1、具有離子交換集團(tuán)的纖維素。2、具有離子交換集團(tuán)的交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。3、被覆以離子化物質(zhì)的細(xì)粉。4、凝膠合成的高度交聯(lián)樹(shù)脂。親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特

8、異性，即生物分子間具有的專注性親和力的層析技術(shù)。在一定條件下，二者能嚴(yán)密結(jié)合成復(fù)合物，如將復(fù)合物的知一方固定在固相載體上，那么可從溶液中專注性地分別和提純另一方。親和層析法：利用生物大分子之間具有的專注性親和力 (1)親和層析支持物的選擇：非特異性吸附低；液體流速快；在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；有適宜豐富的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié) 合；有豐富的微孔，以添加結(jié)合容量。最常用的支持物是Separose4B瓊脂糖珠 (2)配體的選擇條件：抗原或抗體必需單一特異性；抗原與抗體必需具有較高的親和力；配體必需有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)。親和層析抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法

9、達(dá)數(shù)十種，可歸納為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法。結(jié)合法的步驟是先活化支持物上的功能集團(tuán)，抗原抗體銜接到這些活化的集團(tuán)上。(4)親和層析條件的選擇： 封鎖活性基團(tuán)：用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過(guò)柱；除去未結(jié)合和結(jié)合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脫，再用解脫劑處置；解脫劑：3mol/L 硫氰酸鉀或鈉、0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液制備菌體抗原的方法是A 100加溫2小時(shí) B 0.5%甲醛C 75%乙醇 D 1%氯化鈣E 2氯仿分別亞細(xì)胞成分最常用的方法是A 凝膠過(guò)濾法 B 低速離心法C 超速離心法 D 選擇性沉淀法E 高速離心法配制綿羊紅細(xì)胞免疫原普通細(xì)胞濃度為A 103ml B 1

10、04ml C 105ml D 106ml E 107ml 顆粒性抗原免疫接種的方法通常采用A 皮下注射 B 淋巴結(jié)注射C 肌肉注射 D 皮內(nèi)注射E 靜脈注射免疫球蛋白片段的制備免疫球蛋白具有抗體活性，五類免疫球蛋白都能用純化的方法提取出來(lái)。將其分解成片段，如Fab段、Fc段和輕鏈等作為免疫原制備抗血清，能制得分辨才干更高的特異性抗體，制備方法如下：免疫球蛋白片段的制備： 非共價(jià)鍵解離法改動(dòng)pH 、利用強(qiáng)變性劑 共價(jià)鍵解離法氧化法和復(fù)原法 溴化氰裂解法 酶解法木瓜酶 、胃蛋白酶 酶裂解法酶對(duì)免疫球蛋白的水解有極好的專注性。如木瓜蛋白酶可將IgG裂解成一個(gè)Fc和兩個(gè)Fab片段；胃蛋白酶可將水解成F

11、ab2和數(shù)個(gè)小片段；胰蛋白酶將IgG切成不規(guī)那么肽鏈。用木瓜酶水解得到的Fc段作為抗原制備重鏈血清，胃蛋白酶水解抗體試劑用。三純化抗原的鑒定蛋白含量測(cè)定：紫外吸收法、雙縮脲法、酚試劑法分子量測(cè)定：SDS、凝膠過(guò)濾純度鑒定：醋酸纖維膜電泳、SDS、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、高效液相層析免疫活性鑒定：雙向免疫分散、免疫電泳、ELISA三、半抗原性免疫原的制備 半抗原(hapten)：僅有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)如多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等 載體(carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)蛋白質(zhì)：牛血潔白蛋白、人血潔白蛋白、兔血潔白蛋白 牛甲狀腺球蛋白 血藍(lán)蛋白多肽聚合物：多聚賴氨酸polyly

12、sine 大分子聚合物：羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose, CMC) 聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone,PVP 一載體物理方法：利用經(jīng)過(guò)電荷和微孔吸附半抗原 吸附的載體有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等 二半抗原與載體的銜接方法化學(xué)方法：利用某些功能基團(tuán)將半抗原銜接到載體上 帶有游離氨基或羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原：碳二亞胺法 戊二醛法 混和酸酐法 過(guò)碘酸氧化法 不帶氨基和羧基的半抗原：用化學(xué)方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，再與載體銜接 三半抗原性免疫原的鑒定一個(gè)載體分子至少要銜接20個(gè)以上的半抗原分子 半抗原與載體的比例測(cè)定：吸收

13、光譜分析法放射性核素標(biāo)志半抗原滲入法制備人工抗原時(shí)，最常用于偶聯(lián)半抗原的載體是A 牛血潔白蛋白 B牛甲狀腺球球蛋白C 人血潔白蛋白 D 人甲狀腺球蛋白E 兔血潔白蛋白第二節(jié) 免疫佐劑免疫佐劑：那些與抗原一同或先于抗原注入機(jī)體后，可加強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)對(duì)或改動(dòng)免疫應(yīng)對(duì)的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑,簡(jiǎn)稱佐劑. 非免疫原性的佐劑:氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、外表活性劑、藻酸鈣、人工合成的多聚肌苷酸和胞壁肽。 具有免疫原性的佐劑:如卡介苗、枯草分支桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素脂多糖和細(xì)胞因子。用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、poly IC、胞壁酰二肽、細(xì)胞因子、熱

14、休克蛋白常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐劑：弗氏佐劑(Freunds adjuvant) 一、佐劑的種類 弗氏佐劑(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐劑羊毛脂與液體石蠟的混合物弗氏不完全佐劑弗氏完全佐劑加卡介苗乳化方法： 研磨法和攪拌混合法 細(xì)胞因子佐劑與抗原合用，可以更有效激發(fā)機(jī)體免疫功能，加強(qiáng)免疫反響。白細(xì)胞介素2IL2、IL1、干擾素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子CSF，GMCSF具有佐劑作用。抗寄生蟲或腫瘤疫苗研討運(yùn)用中，在細(xì)胞因子佐劑輔助下，刺激機(jī)體產(chǎn)生具維護(hù)作用的細(xì)胞免疫。一、佐劑的種類 1、加強(qiáng)免疫原性 使弱免疫原性物量變成耐久或強(qiáng)的免疫原。2、添加抗體的滴度 提高機(jī)體初次和再次免

15、疫應(yīng)對(duì)的抗體滴度。3、引起或加強(qiáng)遲發(fā)性超敏反響 由于佐劑作用引起過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)對(duì)導(dǎo)致病理生理反響。二、佐劑的免疫生物學(xué)作用 改動(dòng)抗原物理性狀，延緩其降解和排除，更有效刺激免疫系統(tǒng)。 刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，加強(qiáng)其處置和提呈抗原的才干。 刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化。 三、佐劑的作用機(jī)制第三節(jié) 抗血清的制備 抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動(dòng)物，該動(dòng)物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體 多克隆抗體的產(chǎn)生表示圖多克隆抗體(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多種B淋巴細(xì)

16、胞克隆產(chǎn)生的多種抗體的混合物 抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬的關(guān)系 種屬差別越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng) 動(dòng)物個(gè)體的選擇 適齡、安康、體重符合要求 抗原的性質(zhì)IgE對(duì)綿羊，胰島素對(duì)家兔免疫后不易出現(xiàn)抗體一、免疫動(dòng)物的選擇免疫原的劑量 中間劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量添加可獲得高效價(jià)抗體 免疫間隔時(shí)間 第一次和第二次間隔1020天，三次及以后間隔710天免疫途徑 皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié) 二、免疫方法和途徑抗體產(chǎn)生的階段：1、靜止期2天血液中無(wú)抗體，僅有抗原。2、指數(shù)期4天動(dòng)物體內(nèi)抗體程度上升，抗體含量67天達(dá)頂峰3、穩(wěn)定期24周相對(duì)穩(wěn)定程度4、下降期幾個(gè)月至一到兩年二、免疫方法和途徑頸動(dòng)脈采血法：家兔、綿羊、

17、山羊 心臟采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、雞 靜脈采血法： 家兔、山羊、綿羊 三、動(dòng)物采血法第四節(jié) 抗血清的鑒定和保管抗體特異性的鑒定：雙向免疫分散法抗體效價(jià)的鑒定：凝集實(shí)驗(yàn) 、雙向免疫分散實(shí)驗(yàn)、ELISA 抗體純度的鑒定：SDS、雙向免疫分散實(shí)驗(yàn)、免疫電泳 抗體親合力的鑒定：平衡透析法、ELISA、RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn) 一、抗血清的鑒定在瓊脂平皿上打兩排孔，一排放抗原粗提物和純化抗原，另一排加抗血清，37溫箱，進(jìn)展雙向分散1824h后，察看兩排孔的沉淀線?？寡迮c粗抗原出現(xiàn)一條線，產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體雙向免疫分散對(duì)抗體特異性鑒定雙向免疫分散法對(duì)抗體效價(jià)的鑒定測(cè)定抗體效價(jià)有兩種稀釋方法：1、稀釋抗血清

18、，倍比稀釋，分別與一個(gè)濃度的純抗原反響。2、同時(shí)稀釋抗原和抗血清，即將抗原作倍比稀釋或按濃度稀釋，分別與不同濃度抗血清進(jìn)展雙分散實(shí)驗(yàn)。鑒定純化方法：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDSPAGE28保管：短期保管冰凍保管：保管5年真空枯燥保管：保管510年二、抗血清的保管第五節(jié) 抗血清的純化 抗原免疫動(dòng)物制備的抗血清是成分復(fù)雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關(guān)的成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鹽析法：硫酸銨鹽析法、硫酸鈉鹽析法 凝膠過(guò)濾法：常結(jié)合鹽析法 離子交換層析法：DEAE纖維素、QAE-sephadex、QAE纖維素 親和層析法：純化抗原或SPA交聯(lián)Sepharose 4B制成親和層析柱 一、特異性IgG抗體單價(jià)特異性抗血清血清只與其特異性抗原發(fā)生反響。免疫原不純，含有微量的雜抗原，制備出的抗血清出現(xiàn)23種雜抗體。即使用純抗原，用高度純的IgG免疫動(dòng)物，出現(xiàn)的抗體總會(huì)有抗r重鏈的抗體。親和層析法：雜抗原交聯(lián)Sepharose 4B柱吸附劑方法：借助雙功能試劑用不含特異抗原的抗 原混合液制成固相吸附劑二、單價(jià)特異性抗血清1什么是免疫原？ 2如何制備可溶性抗原？ 3常用的細(xì)胞破碎方法有哪些？ 4銜接半抗原的載體有哪些？制備半抗原性免疫原的方法有哪些