人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定

1、人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定【摘要】目的 利用PCR技術(shù)擴增hIL-8 cDNA，將其連接于原核表達(dá)載體pKpL-3a（含PL啟動子）中,并在大腸桿菌中表達(dá)、鑒定。方法 PCR技術(shù)擴增hIL-8 cDNA獲取目的基因，將該基因重組到大腸桿菌表達(dá)載體pKpL3a質(zhì)粒中，重組DNA分子轉(zhuǎn)化到Pop2136大腸桿菌中，利用其所產(chǎn)生的溫度敏感性阻遏蛋白來調(diào)控外源基因表達(dá)，經(jīng)ELISA反應(yīng)檢測其表達(dá)水平。結(jié)果 帶hIL-8基因的重組pKpL3a質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到Pop2136大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)，表達(dá)了IL-8并經(jīng)ELISA反應(yīng)檢測了其表達(dá)水平。結(jié)論：hIL-8成功在大腸桿菌中表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】h

2、IL-8 PCR 重組基因 表達(dá)正文趨化因子（Chemokine）是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子，能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8）屬于趨化因子家族成員，其分子中含有Cys-X-Cys的三聯(lián)氨基酸序列，因而屬于CXC趨化因子亞家族（家族）。IL-8的重要生物學(xué)功能是對中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞具有區(qū)劃作用，并可促進中性粒細(xì)胞的活化，在炎癥反應(yīng)中是一種重要的炎癥因子。另外，IL-8還具有促進造血細(xì)胞增殖及新生血管生成作用，在傷口愈合和腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。由于天然來源的IL-8含量極低，難以大批量制備，因而只能

3、利用基因工程技術(shù)進行表達(dá)和生產(chǎn)。其基本過程是：獲取目的基因；表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建；目的基因與表達(dá)載體的拼接；重組DNA分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌；使其復(fù)制轉(zhuǎn)錄并合成重組的免疫分子。利用重組技術(shù), 可使大腸桿菌成為生產(chǎn)IL-8的生物工廠。這種生物工廠一旦建造成功, 只要供給大腸桿菌適當(dāng)?shù)纳L條件, 就可提供取之不盡的IL-8。1 材料與方法1.1 主要材料1.1.1 菌株與載體Pop2136大腸桿菌和含pKpL-3a質(zhì)粒的大腸桿菌由本實驗室提供。1.1.2 工具酶與試劑TaqDNA聚合酶及其buffer購于北聯(lián)生物醫(yī)學(xué)工程公司。dNTPmix購于Takara公司。Klenow酶購于北聯(lián)生物醫(yī)學(xué)工程公司。

4、內(nèi)切酶Sty、Xba購于Takara公司。T4 DNA連接酶及其buffer購于Takara公司。1.1.3 PCR引物的設(shè)計、合成上游5引物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt；下游3引物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct(內(nèi)含Xba酶切位點和TAA終止密碼)由Takara公司合成。1.1.4 主要儀器PCR儀，微量加樣器（20l、200l、1000l），高速臺式離心機，DYY-10型電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)，水浴搖床，孵箱，酶標(biāo)儀，一次性酶標(biāo)板等。1.2 試驗方法1.2.1 PCR技術(shù)擴增hIL-8cDNA在Eppendo

5、rf管中依次加入下列成份構(gòu)建總體積為50l的反應(yīng)體系：ddH2O 37l、10buffer 5l、dNTPmix 5l、上游引物1l、下游引物1l、cDNA模板1l、Taq酶 1l。調(diào)節(jié)PCR儀，設(shè)置95預(yù)變5分鐘。 9430秒，6030秒，721分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)。最后72再延伸5分鐘。在設(shè)定好的PCR儀上進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取出10l進行瓊脂糖凝膠電泳。向管中余下的40l反應(yīng)體系中加入Klenow酶 1l，室溫30分鐘，以修平擴增片段的3末端。之后轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，加入50l酚-氯仿-異戊醇并混勻，10000rpm，30秒離心。吸取上層清液轉(zhuǎn)至另一已加入5l 3M NaAc的1.5

6、ml離心管中，加入150l無水乙醇，-20放置1小時。10000rpm，10分鐘離心，棄上清，加入0.5ml 70%乙醇，10000rpm，5分鐘離心，棄上清，空氣中干燥，溶于20l TE。1.2.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳配置0.8%瓊脂糖凝膠板。充分凝固后從制膠槽中卸下凝膠板，放入電泳槽，加入TAE（1），使其液面略高于瓊脂糖板，拔出樣品梳。DNA樣品10l加5lGEBS樣本液，在蠟面紙上混勻，全部加樣于瓊脂糖的樣品孔中。穩(wěn)壓電泳80v約2小時，是溴酚藍(lán)指示劑泳動到適當(dāng)位置，1-5v/cm。取出凝膠板置溴化乙錠中染色20分鐘。在凝膠成像儀觀察結(jié)果。1.2.3 質(zhì)粒提取從轉(zhuǎn)化平皿上接種一單菌落

7、到LA培液體養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌濃度增至OD600=1.5時，收獲細(xì)菌。取菌液1ml轉(zhuǎn)至Eppendorf管中，8000rpm，2分鐘離心，棄上清。加入200l緩沖液A，充分混勻。加200l堿溶液裂解細(xì)菌，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次至溶液清亮，開蓋后能拉出絲狀粘稠液體。加200l乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次混勻，冰浴10分鐘（寧短勿長）。10000rpm 5分鐘離心，上清轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20放置1小時。10000rpm 5分鐘離心，棄上清，加入70%乙醇0.5ml。10000rpm 5分鐘離心，棄上清，干燥。加入50l TE使質(zhì)粒溶解，酶切備用。1.

8、2.4 限制性內(nèi)切酶消化取兩個Eppendorf管分別標(biāo)記A、B，依次加入下列物質(zhì)構(gòu)建兩個反應(yīng)體系。A管：ddH2O 16l 、10H buffer 2l、質(zhì)粒DNA 1l、Sty1l。B管：ddH2O 14l 、10M buffer 2l、0.1%BSA 2l、PCR產(chǎn)物1l、Xba1l。37水浴45分鐘。A管中加入1l Klenow酶、2l dNTPmix，室溫30分鐘，加50l酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100l無水乙醇、4l乙酸鈉，混勻，-20沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100l 70%乙醇洗滌

9、一次，干燥。加入2l 10M buffer、2l 0.1%BSA、1l Xba，37水浴45分鐘。加50l酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100l無水乙醇、4l乙酸鈉，混勻，-20沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100l 70%乙醇洗滌一次，干燥。加20l TE進一步用于連接反應(yīng)。B管中加50l酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100l無水乙醇、4l乙酸鈉，混勻，-20沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100l 70%乙醇洗滌一次，

10、干燥。加20l TE進一步用于連接反應(yīng)。1.2.5 DNA連接在Eppendorf管中加入下列物質(zhì)構(gòu)建反應(yīng)體系進行連接反應(yīng)：H2O 9.5l、10T4 DNA連接酶buffer 2.5l、pKpL3質(zhì)粒DNA 7l、IL-8 PCR產(chǎn)物5l、T4 DNA連接酶1l。置12-16水浴反應(yīng)過夜。65水浴15分鐘，滅活T4 DNA連接酶，用于轉(zhuǎn)化。1.2.6 轉(zhuǎn)化將無質(zhì)粒大腸桿菌pop2136接種于1ml LB培養(yǎng)基37培養(yǎng)3-5小時。待OD600=0.4時轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，8000rpm 2分鐘離心，棄上清。加200l 100mM Cacl2混勻，冰浴30分鐘。加10l連接好的質(zhì)粒DN

11、A，混勻，冰浴30分鐘，37水浴2分鐘，冰浴2分鐘。加入1ml LB培養(yǎng)基，37培養(yǎng)0.5小時。取出50l涂于LA培養(yǎng)皿上（含氨芐青霉素），37倒置培養(yǎng)過夜，檢查轉(zhuǎn)化菌是否生成(只有轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能在平皿上生長)。1.2.7 細(xì)胞因子的測定ELISA雙抗體夾心法包被：將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100l/孔，放置濕盒中，4 24小時。洗滌：加入洗滌液洗滌1分鐘/次，共3次。加樣：加入待測樣品、陰性對照及倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，100l/孔，放置濕盒中，37 30分鐘。洗滌：同前。加酶標(biāo)抗體：100l/孔，100l/孔，放置濕盒中，37 30分鐘。洗滌：同前。加顯色劑：A液（TMB，四甲基聯(lián)苯胺

12、）1滴，B液（H2O2）1滴，室溫顯色5-10分鐘。終止反應(yīng)：加中止液（2mol/L H2SO4）。測OD值：酶標(biāo)儀測450nm處OD值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 結(jié)果2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳見圖1。檢查擴增結(jié)果，9組都見一致的擴增區(qū)帶，PCR產(chǎn)物與設(shè)計的228bp相符，并無非特異性擴增，說明目的基因擴增成功。1 2 3 4 5 6 7 8 9圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析注：PCR Products:228bp2.2 ELISA雙抗體夾心法檢測IL-8含量所測OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1和圖2。 LINK Excel.Sheet.8 F:課件免疫試驗實驗結(jié)果.xls

13、 Sheet1!R54C1:R62C14 a f 5 h * MERGEFORMAT 表1 450nm處OD值 LINK Excel.Sheet.8 F:課件免疫試驗實驗結(jié)果.xls Sheet1!R52C1:R62C13 a f 5 h * MERGEFORMAT 4組Measurement count: 1 Filter: 450123456789101112AB0.810.4850.9141.6540.4450.6141.70.2411.5030.155C0.7350.6330.9391.7020.4490.3641.4150.3831.4120.754D0.8360.6180.9211

14、.2370.3660.3841.3390.3521.4810.261E0.8610.7471.1691.840.3580.5750.3430.5420.2260.11F0.3211.1981.512.1360.7040.8820.7041.1080.550.192G0.3771.5652.1981.8760.4480.6540.6120.9490.9150.408H圖2 ELISA雙抗體夾心法標(biāo)準(zhǔn)品OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和試驗所測OD值，計算出待測樣本的hlL-18濃度為10.4ng/ml。3 討論本實驗首先通過PCR技術(shù)擴增hlL-18cDNA，反應(yīng)結(jié)束后取出少量做瓊脂糖凝膠電泳，根

15、據(jù)圖1的結(jié)果可以看出，引物的設(shè)計和PCR反應(yīng)條件的設(shè)計是很成功的。而在PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計尤為重要。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)ZML聚合反應(yīng)（即錯配）。具體實現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素。引物的長度一般為1530bp，常用的是1827bp，但不應(yīng)大于27bp，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)1；引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有較高相似性片段，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配1；末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在

16、引物的3端使用堿基A；引物序列的GC含量一般為40%60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大2; 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2(（A+T）; 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。而本試驗酶切位點設(shè)計在下游3引物上，并且增加了ccg三個堿基來保護酶切位點，是酶切更高效3。把PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒D

17、NA進行限制性內(nèi)切酶消化，然后進行DNA的連接。將hlL-8cDNA片段插入pKpL3質(zhì)粒中，有三種方法可選。一是兩個平端連接；二是兩個粘端連接；三是一個平端和一個粘端連接。分析這三種連接方法，第一種方法優(yōu)點是設(shè)計簡單，但是缺點也很明顯，連接反應(yīng)慢、片段位置易倒置、容易形成多個重復(fù)序列等。第二種方法優(yōu)點是連接緊密，特異性高，但酶切位點設(shè)計比較復(fù)雜。所以綜合以上情況，本實驗采用第三種辦法。3端用Klenow酶補齊，5端用Xba進行酶切，使之產(chǎn)生互補粘端。經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理后，小批量誘導(dǎo)hlL-8表達(dá)，經(jīng)純化后，進行ELISA雙抗體夾心法檢測，由圖2可以大致估算出hlL-8的濃度4。另外，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿

18、菌在LA平皿上進行培養(yǎng)，長出的大腸桿菌說明其細(xì)胞均內(nèi)含有質(zhì)粒，但不能說明其質(zhì)粒中都含有目的基因片段。所以要對培養(yǎng)出的大腸桿菌做進一步的鑒定。由于本實驗沒有做這一步，所以有必要在這里討論一下。挑單個菌落接種于1ml LA培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)后可進一步提取質(zhì)粒進行DNA電泳；或者用限制性內(nèi)切酶酶切后進行DNA電泳，看是否含有目的基因片段。還可以小批量誘導(dǎo)重組IL-8表達(dá)，然后進行SDS電泳，鑒定重組蛋白的分子量。本試驗成功地構(gòu)建了hlL-18重組原核表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌成功地表達(dá)了重組蛋白，為進一步研究hIL-18的功能及應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。參考文獻1 張成崗，賀福初. 生物信息學(xué)方法與實踐M. 北京：科學(xué)出版社，2002, 64,-66.2 賀林. 解碼生命-人類基因組計