不同地域銀杏大蠶蛾的遺傳多樣性

1、不同地域銀杏大蠶蛾的遺傳多樣性Genetic diversity assessment of Dictyoplocajaponica from different areas. YANG Bao-Shan1 ， 2* ， CAOLan-Juan3 ， LI Jun3 ， LI Yi-Ren3 ， WA NG Z huo3， QINLi3DK3*(1. College of Plant Protection, ShenyangAgricul tural University, Shenyang 110161, China; 2.School of City Development Un iver

2、sity of Jinan, Jinan250002, China; 3. College of Bioscience and Techn ology,Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,China)Dictyoploca japonica Moore is one of the importantforest pests, which tendsto break out and spread in some parts of China.Inter-simple sequence rep eats (ISSR) were use

3、d asmolecular markers to detect the genetic diversity of 10geographical populations of D. japonica. The resultsshowed that 20 ISSR pr imer s identified from 35 couldcreate 299 distinguishable bands, 250 of which were polymorphic. The percentage of polymorphism was 83.61%. Therelative distance val ue

4、s between different D. japonicaraces were 0.231 50.414 7. Cluster an alyse s were performed based on the genetic distance matrix by using UPGMA method, whi ch demonstrated that population differentiation has taken place in D. japonica .銀杏大蠶蛾Dictyoploca japonica Moore ，又名栗蠶、白果蟲(chóng)，屬鱗翅目大蠶蛾科，是 一種重要的林業(yè)害蟲(chóng)，在

5、我國(guó)分布 較為廣泛，危害 30 多種經(jīng)濟(jì)林木 1 。近年來(lái)在我國(guó)局部地區(qū)有暴發(fā)成災(zāi)的報(bào)道，1 9961998年在陜西省部分地區(qū)大發(fā)生，危害核桃樹(shù)200 多萬(wàn)株 2； 1998 年首次在 貴陽(yáng)白云區(qū)發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)； 2006 年首次發(fā)現(xiàn)銀杏大蠶蛾在甘肅省隴南市康縣、徽縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生，發(fā)生面積240多hmZ在局部地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，并有逐步擴(kuò)散蔓延的趨勢(shì)3。同時(shí)，銀杏大蠶蛾又是一種泌絲昆蟲(chóng)， 由于其絲有獨(dú)特的熒光閃爍性而倍受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注 ，蛹中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為醫(yī)藥、化工、食品、發(fā)酵業(yè)等領(lǐng)域的重要原材料。 1994 年遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所進(jìn)行了銀杏大蠶蛾的馴養(yǎng)技術(shù)研究4。但關(guān)于銀杏大蠶蛾的種群分化

6、及遺傳多樣性研究還未見(jiàn)報(bào)道。分子標(biāo)記技術(shù)在研究生物遺傳多樣性方面得到了應(yīng)用， 簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simplesequence repeat , ISSR)是由 zietkiewiez 等人于 1994 年 創(chuàng)建的，以微衛(wèi)星重復(fù)序列作為引物檢測(cè)物種多態(tài)性的 DNA#子標(biāo)記。 其原理是利用真核生物基因組中廣泛存在的簡(jiǎn)單重復(fù)序歹U (simple sequence repeat , SSR 來(lái)設(shè)計(jì)引物，在 SSR的 5,或3端加錨14個(gè)喋吟或嚅 咤堿基，再以此為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的一段基因組DNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離獲得多態(tài)性圖譜 5。ISS

7、R 技術(shù)已用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、DN停旨紋圖譜繪制、系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域，而在動(dòng)物遺傳研究中應(yīng)用較少 6， 7。為了有效地利用泌絲昆蟲(chóng)資源， 控制該害蟲(chóng)的危害， 查明我國(guó)銀杏大蠶蛾的種群分布及不同 地域間的親緣關(guān)系，作者采用ISSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)收集的10個(gè)不同地域的銀杏大蠶蛾進(jìn)行了DN夠態(tài)性研究，旨在為銀杏大蠶蛾資源的保存、利用、指紋圖譜構(gòu)建及其防治提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。1 材料與方法、 1.1 材料10個(gè)不同地理種群的銀杏大蠶蛾材料分別來(lái)自吉林蛟河、遼寧丹東、遼寧東港、遼寧鳳城、 遼寧岫巖、遼寧大連、湖北恩施、 廣西南寧、 重慶巫溪及遼寧鳳城馴化種 （表 1 ） 。 表 1 供

8、試?yán)跣Q材料（2006） 序號(hào)采集地點(diǎn)采集時(shí)間（月- 日） 寄主植物 1 遼寧省莊河市8-6 核桃楸 2遼寧省東湯8-10 核桃楸 3 遼寧省東港市 8-10 核桃楸 4 遼寧省岫巖8-10 核桃楸 5 遼寧省普蘭店市7-28 核桃楸 6 重慶市巫溪縣7-15 核桃楸7 廣西南寧市7-8 楓楊 8 湖北省恩施市7-8 銀杏 9 吉林省蛟河市8-15 核桃楸 10 遼寧省鳳城（馴化） 8-10 核桃楸 11 遼寧省鳳城市 8-10 核桃楸1.2 方法基因組DNA勺提取 基因組DNA勺提取參考宋憲軍、 趙巧玲 9 的方法略有改進(jìn)， 混合取樣 提取基因組DNA，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

9、ISSR-PCR 擴(kuò)增 引物序列參考候成香ZW（* 侯成香 ,李木旺 , 苗雪霞，等. 中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第四屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集.廣州：2004 . 165170.ZW）、李木旺ZW（*李木旺， 侯成香 , 苗雪霞， 等 . 中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第四屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集.廣州：200 4. 8895. ZW）的報(bào)道，從35個(gè)引物（由 大連寶生 物公司合成） 中篩選出 20 個(gè)擴(kuò)增帶豐富的引物 （表 2） 。PC版應(yīng)體系為25以L(fǎng): 10.8以L(fǎng) ddH2O, 2.5以L(fǎng) 10X buffer（含 25 mmol/L MgCl2） ,1 以 L dNTP 7.5 以 L Primer , 0.2以L(fǎng)

10、 Taq DNA酶（5 U/以L(fǎng)）（購(gòu)自大連寶生物公司），3以L(fǎng)模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)?94 預(yù)變性 5 min ， 94 變性 1 min ， 5060 C退火1 min , 72 C延伸2 m in ; 36個(gè)循環(huán)后，72 C 延伸10 min o不同的ISSR引物退火溫度不同，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 調(diào)整各個(gè)引物的退火溫度（表 1）。PCRT物用1.5%的瓊脂糖 凝膠進(jìn)行電泳，DNA Marker為100 b p ladder marker （購(gòu)自大 連寶生物公司） ， 采用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照， 并記錄電泳結(jié)果。數(shù)據(jù)分析 每條擴(kuò)增片段計(jì)作1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶按有或無(wú)記錄， 有帶計(jì)

11、為 1， 無(wú)帶計(jì) 為 0。 列出 0 、 1矩陣輸入NTSYSpc 2.1生物軟件，用UPGM袪計(jì)算遺傳距離。結(jié)果與分析ISSR 擴(kuò)增帶譜及其多態(tài)性采用 20 個(gè)不同引物對(duì)10 個(gè)不同地域的銀杏大蠶蛾基因組DNAS行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表2。20個(gè)引物對(duì)10個(gè)不同地域的銀杏大蠶蛾基因組 DNAT增出 299條清晰穩(wěn)定的條帶，擴(kuò)增片段大 小在1002?000 bp之間， 每個(gè)引物擴(kuò)增的帶數(shù)不等， 在1021條之間，平均擴(kuò)增的帶 數(shù) 為 14.5 條。其中的 250 條片斷表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性片斷的比例為83.61 %,擴(kuò)增帶數(shù)最 多的引物為（CAC 4GC共擴(kuò)增出21 條帶， 并且其中的 18 條有多態(tài)

12、性， 擴(kuò)增帶數(shù)最少的為 （TG）8GT 和GGG（TGGGG）2TG為10條帶，其中各有 8條有多態(tài)性。多 態(tài)性比例最低的是（AC）8GG,為63.15 %。從（圖1, 2）結(jié)果看， 20 個(gè)引物都具有較高的標(biāo)記多態(tài)性。不同地域銀杏大蠶蛾的遺傳距離及UPGM聚類(lèi)分析根據(jù) 20 個(gè)引物的擴(kuò)增帶譜統(tǒng)計(jì)分析， 計(jì)算出 10 個(gè)不同地域銀杏大蠶蛾的相對(duì)遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表 3。由表 3 看， 遼寧丹東和遼寧東港的銀杏大蠶蛾相對(duì)遺傳距離最小，為 0.231?5 ，遼 寧鳳城與遼寧大連的相對(duì)遺傳距離最大，為 0.414?7 ，遼寧鳳城馴化種與東北地區(qū)其 它地域銀杏大蠶蛾 之間的遺傳距離較小， 說(shuō)明其親緣關(guān)系

13、較近， 而遼寧大連種群與其它種群之間的遺傳距離均較大，可能與其生存的生態(tài)環(huán)境有關(guān)系。從圖 3 的聚類(lèi)圖中可以看出，供試的銀杏大蠶蛾按照地域的不同分成4 個(gè)類(lèi)群， 分布于遼寧大連及廣西南寧的銀杏大蠶蛾分別單獨(dú)分為一類(lèi)，重慶巫溪和湖北恩施的類(lèi)群聚在一起，分布于東北地區(qū)的銀杏大蠶蛾大部分聚在一起， 但又分為不同的亞類(lèi)， 說(shuō)明不同地域銀杏大蠶蛾親緣關(guān)系不同， 可能是由于適應(yīng)不同的環(huán)境條件而發(fā)生了遺傳分化。討論ISSR 技術(shù)自產(chǎn)生以來(lái)得到廣泛應(yīng)用，但多用于植物，而在昆蟲(chóng)中并不多見(jiàn)。由于各引物的退火溫度不同，增加了試驗(yàn)的復(fù)雜性，本試驗(yàn)采用混合取樣提取基因組DNA經(jīng)3次重復(fù)，所得擴(kuò)增條帶一致，有較好的重復(fù)性

14、。試驗(yàn)表明，ISSR標(biāo)記技術(shù)具有很高的多態(tài)性，可以應(yīng)用 于銀杏大蠶蛾遺傳多樣性分析。由遺傳距離（ 表 3） 和聚類(lèi)分析圖 （ 圖 3） 可圖 1 引物 I6 的ISSR擴(kuò)增結(jié)果圖2引物 I14 的擴(kuò)增結(jié)果泳道： 1. 遼寧丹東 2. 遼寧東港 3. 遼寧岫巖 4. 遼寧大連 5. 重慶巫溪 6. 湖北恩 施 7. 吉林蛟河 8.遼寧鳳城馴化種 9. 遼寧鳳城野生種 10. 廣西南寧（表3 同）以看出， 不同地域的銀杏大蠶蛾已發(fā)生遺傳分化， 總體上還是以地域聚類(lèi)在一起，湖北恩施和重慶巫溪聚在一起，廣西南寧單獨(dú)聚為一類(lèi)， 唯有遼寧大連在聚類(lèi)上單獨(dú)聚為一類(lèi)， 這可 能是由于該地區(qū)環(huán)境條件比較獨(dú)特所造成的， 大連市位于遼東半島有海洋性氣候的特點(diǎn)，雖然在東北地區(qū)， 但由于氣候的不同， 銀杏大蠶蛾種群的遺傳性發(fā)生 的變化。