五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說明書

1、Word文檔 五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說明書 五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說明書 u產(chǎn)品說明 五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程中的熒光信號變化，自動判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為103CFU/ml。 產(chǎn)品組成（96測試） 所需儀器 ABI，BioRad，TaKaRa等PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定性判讀時則無需電泳設(shè)備） 自備耗材和儀器 滅菌1.5mL或2.0mL離心管；冰盒；移液器（0.5-10L，10

2、-100L，100-1000L）及配套滅菌吸頭；離心機(jī)；渦旋混勻器；金屬浴。 樣品處理 參照GB4789.62021食品平安國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)中的操作步驟進(jìn)行前增菌。建議使用試劑配套細(xì)菌基因組DNA提取系列產(chǎn)品。 試驗(yàn)操作 1.試劑配制（試劑配制區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）取出各管試劑，將試劑完全解凍，離心30s。取12(所待檢樣品數(shù)+3)的PCR反應(yīng)管，按12個一組排列并編號，依次向各管中加入23L的12種反應(yīng)液。 2.添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）向每管反應(yīng)液中分別加入2L模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。加樣示例：（有N個待測樣品） 取

3、(N+3)組12個一組的反應(yīng)管，按挨次第一組12管中全部加入2L的NG-DW，其次組12管中全部加入2L的NG-Ecoli，第三組12管中全部加入2L的樣品1模板，第四組12管中全部加入2L的樣品2模板，最終組12管中全部加入2L的PG-Ecoli。 蓋好PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，馬上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 3.擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)） 按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：（如需使用熒光法進(jìn)行檢測請選擇FAM通道） PCR循環(huán) 熒光收集位點(diǎn) 37 10分鐘 1個循環(huán) 95 10分鐘 1個循環(huán) 95 30秒 30個循環(huán) 63 30秒 72 90秒 72 5分鐘 1個循環(huán) 4.產(chǎn)物電泳（擴(kuò)

4、增及產(chǎn)物分析區(qū)） 稱量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全溶化形成清亮透亮的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60右時，加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5g/mL， 充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度宜為3mm5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭當(dāng)心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠完全凝聚硬化后,輕輕拔出梳子，當(dāng)心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰。向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm2mm。將5L PCR產(chǎn)物與1L 6上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸

5、取混合液垂直伸入液面下膠孔，當(dāng)心上樣于孔中；陽性對比的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入到最終一個泳道;第一個泳道中加入2 L分子量Marker。接通電泳儀電源，依據(jù)公式：電壓=電泳槽正負(fù)極間的距離（cm）5V/cm計算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動電壓開關(guān)，電泳開頭以正負(fù)極鉑金絲消失氣泡為準(zhǔn)。電泳30min45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀看結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。 u可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。 u推舉使用DNA Marker：DL2021或100bp ladder，等可指示100bp1500bp條帶的Marker。 結(jié)果分析 1.陰陽性判讀： 進(jìn)行電泳

6、檢測時，需對比Marker進(jìn)行推斷，當(dāng)目的靶標(biāo)對應(yīng)位置消失單一顯著條帶時可推斷該靶標(biāo)為陽性；否則為該靶標(biāo)檢測為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測時，檢測孔Ct30時推斷該孔為陽性；當(dāng)檢測孔Ct30時，該檢測孔為陰性） 示例電泳圖2.有效性判讀： 需同時滿意：1.空白對比中全部泳道均為陰性；2.陰性對比中uidA泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對比中全部泳道陽性，此時可推斷試驗(yàn)有效。如無法滿意上述條件，則試驗(yàn)無效，需重復(fù)試驗(yàn)；如重復(fù)后結(jié)果仍為無效，請于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。 3.結(jié)果判讀： 在試驗(yàn)有效的狀況下，可依據(jù)下表進(jìn)行判讀： 致瀉大腸埃希氏菌類別 目標(biāo)條帶的種類組合 EIEC ipaH（） uidA （） EAEC aggR，astA，pic中一條或一條以上陽性 EPEC bfpB（），eae（），stx1（）stx2，（） STEC/EHEC stx1，stx2中一條或一條以上陽性，eae（），bfpB（） ETEC lt，stp，sth中一條或以上陽性 u97%以上大腸埃希氏菌為uidA陽性，可參考陰性對比中該基因檢測結(jié)果推斷擴(kuò)增效果； u當(dāng)結(jié)果判定為EPEC陽性時，若bfpB靶標(biāo)為陽