植物細胞工程的筆記-原版

1、緒論1生物技術(shù)：以生物科學為基礎(chǔ)，利用生物個體或生物器官，組織，細胞的特性和功能，設(shè)計和構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，以及與工程原理相結(jié)合進行產(chǎn)品加工生產(chǎn)的綜合體系。內(nèi)涵：運用生物學理論與科學技術(shù)改造細胞的遺傳物質(zhì)。2細胞工程：是以細胞學，遺傳學，發(fā)育學及分子生物學等理論為基礎(chǔ)，借助工程學的試驗方法或技術(shù)，在細胞水平上研究和改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞，細胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的科學。3植物細胞工程：以植物組織和細胞為基本單位，在離體條件下進行培養(yǎng)，繁殖，或人為的精細操作，使細胞的某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個

2、體，以獲得有用無知的過程。4細胞全能性：高等植物的組織和器官可以不斷分割，直到單個細胞，如果每個細胞都有植物個體一樣的性質(zhì)和能力，那么可以通過植物細胞培養(yǎng)使單個細胞發(fā)育成為一個新個體。（一個生活細胞所具有完整生物個體的潛在能力）5植物細胞的工程類別培養(yǎng)層次：植株培養(yǎng)。器官培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)，愈傷組織，細胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)（原生質(zhì)體：植物細胞脫除細胞壁后的完整細胞培養(yǎng)。）6應(yīng)用：在植物育種上(1快速獲得特殊倍性材料，2克服遠緣雜交不親和，3克服雜交種胚早期夭折，4導入外源基因，5突變體篩選，6種質(zhì)資源保存），種苗脫毒和快速繁殖，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物，在細胞學說和發(fā)育生物學研究中，在植物遺

3、傳，生理生化以及病理等基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用7 植物組織培養(yǎng) 動物組織培養(yǎng) 細胞全能性 細胞增殖 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 蔗糖，植物激素 葡萄糖，動物血清 植物體 細胞株，細胞系 快速繁殖，培育無毒植株 獲得細胞或細胞產(chǎn)物第一章1生活細胞的全能性必須首先回復(fù)到分生狀態(tài)或胚性細胞狀態(tài)，（條件：離體，適當?shù)拇碳ぃ?植物細胞分類：第一類，莖尖，根尖，及形成層細胞，這類細胞始終保存分裂能力，從一個周期到另一個周期，稱為周期細胞，第二類，篩管，導管和氣孔保衛(wèi)細胞等特化細胞，為永久失去分裂能力的細胞，為終端分化細胞，第三類，表皮細胞及各種薄壁細胞，在通常情況下不分裂，但受到外界刺激后從新啟動分裂，為G0細胞。高

4、度分化的細胞表現(xiàn)細胞全能性的能力降低或喪失，2細胞的脫分化：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細胞狀態(tài)的過程。（靜止細胞啟動分裂都是分化細胞成功脫分化的重要標志，靜止細胞：停止分裂，執(zhí)行特定的代謝功能）3脫分化過程的生理活動與細胞結(jié)構(gòu)的變化：細胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細胞中央，細胞器增加，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認為是細胞脫分化的重要標志。變化最明顯的葉綠體4脫分化的過程：（1）啟動階段，表現(xiàn)為細胞質(zhì)增生，并開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)，（2）演變階段，此時細胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原生質(zhì)體，（3）脫分化終結(jié)期，細胞回

5、復(fù)到分生細胞的階段，細胞分裂即將開始。5植物激素是離體培養(yǎng)中所必須的條件，因此與激素相關(guān)的基因表達被認為是啟動細胞脫分化的關(guān)鍵。6細胞分化：導致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育過程，（一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機能，這是在時間上的分化，同一種細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機能，是空間上的分化）本質(zhì)是基因表達和調(diào)控的結(jié)果7再分化，在離體的條件下，當細胞脫分化以后無序生長的細胞及愈傷組織要重新進入有序生長才能成為新個體?；蜻x擇性表達與修飾的人工調(diào)控過程。8極性：植物的器官，組織甚至單個細胞在不同軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化上的梯度差異，無論低等

6、植物或高等植物都存在。細胞的不均等分裂時細胞極性建立的標志。極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對稱分布和細胞周質(zhì)微管的重排有關(guān)。9管狀分子（TE）由愈傷組織薄壁細胞分化形成，是愈傷組織細胞分化器官的前提，離體培養(yǎng)中TE的出現(xiàn)時組織分化的標志，分為三個階段，葉肉細胞的脫分化，脫分化葉肉細胞向TE細胞轉(zhuǎn)換，TE細胞特化階段10激素對細胞生長與分化的調(diào)控是一個復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控過程。11在離體培養(yǎng)條件下，植物細胞經(jīng)過再分化形成完整的個體通過兩天途徑：器官發(fā)生和體細胞胚發(fā)生第二節(jié)1器官發(fā)生：在培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織)分化形成不定根或不定芽等器官的過程。離體培養(yǎng)下器官發(fā)生的難易，往往取決于研究對象的培養(yǎng)

7、技術(shù)成熟程度及其調(diào)控機制基礎(chǔ)研究的深度。2離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式:1先形成芽，后在芽上形成根，2先形成根，后在根上形成芽，3在愈傷組織的不同部位形成芽和根再通過維管束組織的聯(lián)系形成完整的植株4經(jīng)過愈傷組織再分化器官的過程：1外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織，2形成生長中心，也即愈傷組織形成器官的部位，3器官原基及器官形成不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生：1外植體已經(jīng)存在器官原基，2外植體某些部位的細胞重新分裂后形成分生細胞團，再由分生細胞團形成器官原基5起始材料對器官分化的影響：母體植物的遺傳物質(zhì)（器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導的差異），外植體類型及生理狀態(tài)（外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，有

8、時甚至影響分化程度和器官類型。6離體培養(yǎng)下器官分化，在大多數(shù)情況下時通過外源提供適宜的植物激素實現(xiàn)的，生長素與與細胞分裂素占主導地位。7光照時間，強度及光質(zhì)對器官分化均有影響：1 合子胚 體細胞胚 萌芽率高，質(zhì)量好 萌芽率低，質(zhì)量差受精卵 體細胞胚柄，明顯 即使有也不明顯形態(tài)固定，體積較小 形態(tài)復(fù)雜，體積較大變異率低 變異率高2體細胞的界定：其一：體細胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限與離體培養(yǎng)范圍內(nèi)使用，以區(qū)別無融合生殖胚，其二，體細胞胚起源于非合子細胞，以區(qū)別合子胚，其三，體細胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別與離體培中器官發(fā)生形成個體的途徑3體細胞的形成外植體直接發(fā)生，經(jīng)過愈傷組織的體細胞胚發(fā)生，細胞

9、懸浮液培養(yǎng)的體細胞胚胎發(fā)生，4與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細胞胚發(fā)育再生植株的特點:體細胞具有雙極性，體細胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少，即出現(xiàn)生殖隔離現(xiàn)象5影響體細胞胚發(fā)生的因素：（1）外緣激素（生長素對體細胞胚發(fā)生有重要的調(diào)控，細胞分裂素對維持在促進細胞分裂和維持細胞活躍生長中有重要作用）（2）培養(yǎng)基：（3）不同基因型間體細胞胚形成能力的差異，（4）外植體類型，采用幼胚，成熟胚，上胚軸和子葉為外植體，較容易產(chǎn)生胚性愈傷組織，而采用葉片，莖段等能形成體細胞胚6體細胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)：內(nèi)源激素的變化，特異蛋白質(zhì)，基因表達調(diào)控第二章1體細胞無性系:任何形式的細胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株

10、，而這些植株所表現(xiàn)的變異稱為體細胞無性系2離體培養(yǎng)下的穩(wěn)定性，離體無性繁殖可以具有較高的遺傳穩(wěn)定性，即使發(fā)生變異也可淘汰變異，也可以通過離體培養(yǎng)選擇保留并穩(wěn)定下來3離體培養(yǎng)下的遺傳變異的特點普遍性，局限性，嵌合性4影響體細胞遺傳與變異的因素供體植物(二倍體比單倍體的穩(wěn)定)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式，繼代培養(yǎng)的次數(shù)（時間越久次數(shù)越多，則變異頻率越高，5體細胞變異的細胞遺傳學基礎(chǔ)：DNA核內(nèi)重復(fù)負責，染色體斷裂與重組，非正常的有絲分裂6體細胞變異的分子遺傳學基礎(chǔ)：堿基突變，DNA序列的選擇性擴增與丟失，轉(zhuǎn)座子的活化，DNA甲基化7離體培養(yǎng)誘導篩選體細胞無性系變異的優(yōu)點，（1）由于篩選可以在離體培養(yǎng)下，從而

11、可以在曉空間內(nèi)對大量個體進行選擇，（2）細胞突變體的篩選可以在幾個細胞周期內(nèi)部完成，且不受季節(jié)限制，因此篩選效率高，（3）誘變和篩選的條件可控制，從而提高重復(fù)性，（4）由于變異是在單細胞水平上進行的，因此一個突變體就是來自一個細胞，不會有非突變體細胞的干擾，避免整體植株水平上無性變異常呈現(xiàn)嵌合體，因而可以省去變異分離的麻煩，（5）理化誘變劑可較均勻地接觸細胞，有較高的頻率發(fā)生突變，增加選擇的機會8（1）體細胞變異誘導材料的選擇：注意的問題，目標性狀的可行性，必須充分考慮實驗植物的細胞培養(yǎng)的技術(shù)水平，適當?shù)募毎愋团囵B(yǎng)細胞的自發(fā)變異（3）培養(yǎng)細胞的誘變（物理誘變，化學誘變，復(fù)合因子誘變，轉(zhuǎn)座子插

12、入誘變，）（4）體細胞突變體的篩選（直接篩選法和間接篩選法）9體細胞無性系變異的利用：創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種，基因克隆及功能鑒定，發(fā)育生物學研究，生化代謝途徑研究植物細胞工程技術(shù)原理1實驗室：3個基本需要（實驗準備，無菌操作和控制培養(yǎng)）2洗滌：鉻酸洗滌液是強氧化劑，去污能力很強，特別是在加熱后去污效果更好，一般可在，40到45攝氏度使用，但鉻酸洗滌液同時具有較強的腐蝕性，使用時要小心謹慎，以免發(fā)生意外，僅用于玻璃實驗器皿，可反復(fù)使用，直至溶液呈青褐色為止。洗滌方法，1玻璃器皿：新的玻璃器皿上附有游離的堿性物質(zhì)，其洗滌方法是用1%HCl溶液浸泡一晝夜，再用合成洗滌劑洗刷，然后用清水反復(fù)

13、沖洗，最后用蒸餾水沖洗1到兩次，干燥后即可使用。已經(jīng)使用過的試管，燒杯，三角瓶，將器皿中的殘留除去，用清水洗凈，再用合成洗滌劑洗刷，用清水洗干凈后，最后用蒸餾水沖洗1到2次，內(nèi)徑狹小的玻璃制品，先放入鉻酸洗滌液中浸泡2h以上，經(jīng)流水沖洗半個小時，再用蒸餾水沖洗1到二次，然后烘干，或晾干，載玻片或蓋玻片，先用清水沖洗，然后放入鉻酸洗滌液中浸泡幾個小時，或者是用鉻酸洗滌液煮沸半個小時，取出后用清水沖洗干凈，將其貯藏在95%的酒精中，2塑料品洗滌：用合成洗滌劑，沖洗必須反復(fù)多次，最后用蒸餾水沖洗3金屬用品，用酒精擦拭，不要洗滌劑，并保持干燥3滅菌技術(shù)：滅菌是指殺滅培養(yǎng)物，培養(yǎng)基，培養(yǎng)用具及培養(yǎng)環(huán)境的

14、雜菌，是防止微生物污染的最重要最基本的環(huán)節(jié)，物理方法，利用高溫，射線等殺死微生物或通過過濾，離心沉淀等去除微生物，化學方法，使用消毒劑抗生素殺滅微生物高壓蒸汽滅菌：蒸餾水，各種器械，棉塞，1滅菌鍋可裝滿，2鍋內(nèi)的冷空氣排盡，3嚴格遵守保持壓力的時間，20min 121攝氏度過濾滅菌：用于易于分解而失效的某些化合物質(zhì)，液體培養(yǎng)基和化學試劑濕熱和干熱滅菌，濕熱，玻璃，培養(yǎng)基，干熱，玻璃器皿，金屬，160攝氏度到180攝氏度，恒溫40min，或120攝氏度滅菌2小時 （4）熏蒸，熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，乙二醇，主要用于接種室和培養(yǎng)室滅菌，（5）藥劑滅菌：70%到75%酒精，0.1%到0.2%氧化汞

15、，10%的次氯酸鈉，主要用于培養(yǎng)材料的表面滅菌，（外植體）培養(yǎng)材料的滅菌原則，（重要）既要達到滅菌的目的，又不傷害組織和細胞灼燒滅菌，外焰，接種器械，瓶口，棉塞，包扎紙，瓶蓋 （7）紫外線照射，接種室空氣和臺面，花粉，15到20min4培養(yǎng)基：植物細胞，組織器官吸取各種營養(yǎng)產(chǎn)所的地方，包括水分和各種營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基的配方是決定培養(yǎng)物能否正常生長或者能否達到培養(yǎng)目的的首要前提。成分：無機鹽，有機化合物，生長調(diào)節(jié)劑（基本培養(yǎng)基部含有生長調(diào)節(jié)劑）（1）無機鹽，大量元素（C，H,O，N，P，K，Na，Ca，Mg，S）每升幾十至幾千毫克， 微量元素（鐵，通，鋅，硼，錳，鈷）10的-5次到-7次（2）有機

16、化合物：基本培養(yǎng)基質(zhì)只含有無機鹽類作為碳源利用蔗糖，葡萄糖，果糖，做為氮源利用氨基酸類和酰胺類糖類：既可以做碳源，又可以維持培養(yǎng)基的滲透壓，微生物：直接參與生物催化劑（酶），還參與植物蛋白質(zhì)，脂肪的代謝等重要的生命活動肌醇，腺嘌呤，氨基酸，其他復(fù)合成分，（3）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長素，促進細胞分裂和生長，有利于外植體的脫分化并啟動細胞分裂，有利于形成愈傷組織，吲哚乙酸（IAA），萘乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4D），吲哚乙酸（IBA），細胞分裂素：促進細胞分裂，調(diào)節(jié)器官分化，延遲組織衰老，增強蛋白質(zhì)合成，赤霉素（GA） 水 （5）其他附加成分，瓊脂和活性炭培養(yǎng)基種類：富鹽培養(yǎng)基，高硝態(tài)氮培養(yǎng)

17、基，中鹽培養(yǎng)基，低鹽培養(yǎng)基，如果將某一物質(zhì)的量濃度高的溶液稀釋到低濃度時，m1*V1=m2*V25外植體取材及培養(yǎng)條件的控制，外植體：指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織，器官等材料，它是植物離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)材料。來源：1生長在自然環(huán)境下的植物，2有目的地培養(yǎng)在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物，2無菌條件下已經(jīng)離體培養(yǎng)的植物原則1盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，以減少培養(yǎng)過程中微生物感染，2必須取自自然生長的植物，可以盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔環(huán)境中的植物，3對于在培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染材料，應(yīng)盡量取生長旺盛的生長點部位作為起始培養(yǎng)的外植體。取材大小，0.5到1cm

18、,過大則污染，胚胎培養(yǎng)或脫青，0.5cm以下，過小，不易活供體植物的管理：避免昆蟲為害，注意防病，控制濕度外植體滅菌：次氯酸鹽一般用于一些教幼嫩的組織消毒，消毒時間5到30min， 氯化汞滅菌效果，一般用于種子，塊根，塊莖，及較硬的組織滅菌，但是殘留液最難去除，消毒劑和處理時間及方法會影響到滅菌效果和外植體的活力。種子滅菌，芽，葉片，和莖等組織材料滅菌，未成熟胚，子房，及花藥滅菌，70%的酒精清洗，吐溫是潤濕劑接種條件的控制：1光照（強度，時間，光質(zhì)），2溫度20到30，（適宜的溫度科提高細胞分裂速率，適當提高溫度，有利于細胞伸長，在一定范圍內(nèi)降低，則會，是分裂和生長速度減慢，代謝減慢，有機物

19、積累，細胞質(zhì)量增大），3濕度，（培養(yǎng)容器，100%, 環(huán)境70到80%）4培養(yǎng)基的PH，5.5到6.5，引起培養(yǎng)基PH變化的原因，高溫滅菌，培養(yǎng)物本身代謝產(chǎn)物釋放，5滲透壓 6氣體調(diào)節(jié) ，增加可利用的氧，除去有害氣體，培養(yǎng)皿的封閉性主要與封口方式和材料有關(guān)，振蕩培養(yǎng)時常用的改善通氣條件的培養(yǎng)方式：植物組織和器官培養(yǎng)1植物脫毒和快速繁殖的意義：能夠有效保持優(yōu)良品種特性；生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化；快速繁殖新品種，加速優(yōu)良品種推廣，節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品商品產(chǎn)出率；便于運輸。2病毒在植物體內(nèi)分布不均的機理：能量競爭，傳導抑制，激素抑制，酶缺乏，抑制因子，3植物脫毒的技術(shù)規(guī)程：（1）被脫毒植物攜帶病

20、毒的診斷，指示植物，血清學，分子生物學，母體材料的選擇和預(yù)處理，欲求脫毒材料的品種典型性，對外植體的健康程度進行選擇，（3）莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株，外植體消毒，莖尖剝離，莖尖培養(yǎng)。(4)脫毒檢測，指示植物鑒定，血清鑒定，分子生物學鑒定，（5）脫毒苗的保存與繁殖，脫毒苗的離體保存與繁殖，建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系，木本植物建立隔離的脫毒苗母本園4影響脫毒效果的因素，母體材料病毒侵染的程度，起始培養(yǎng)材料的莖尖大?。ㄇo尖越小，脫毒率越高），外植體的生理狀態(tài)（頂芽脫毒效果比側(cè)芽好，生長旺盛季節(jié)的芽為外植體脫毒比休眠芽或快速進入休眠芽的效果好5離體繁殖： 外植體選擇考慮的三個的問題：植物在自然條件下

21、的繁殖特點，離體條件下莖芽的增殖方式，外植體的取材部分，大小和生理狀態(tài) 培養(yǎng)物的增殖：（1）芽增殖，特點，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖，不需要添加外緣激素，如果某些植物需要使用激素，一定要嚴格控制濃度，以防止產(chǎn)生愈傷組織。不定芽增殖，從現(xiàn)存的芽以外的任何器官和組織上通過器官重新形成的芽稱為不定芽特點，繁殖系數(shù)高，有較好的遺傳穩(wěn)定性體細胞胚增殖：特點：增長率高，胚的雙極性免去了生根環(huán)節(jié)，但在同一培養(yǎng)體系中的體細胞休眠的誘導和解除難以控制而影響大規(guī)模繁殖的規(guī)范性，因此這個需要建立一個相對一致的體胚發(fā)育體系愈傷組織增殖，特點，成功率高，繁殖系數(shù)大，但是遺傳穩(wěn)定性較差，

22、生根培養(yǎng)：降低礦物營養(yǎng)的濃度，提高生長素濃度，具體應(yīng)依據(jù)植物種類而定生產(chǎn)用苗的培植6離體繁殖的使用范圍：某些難以繁殖或繁殖系數(shù)低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型; 自然無性繁殖極易感染病毒的植物 ；有性繁殖變異范圍過大而自然條件下又不易無性繁殖的。7離體繁殖的遺傳變異與控制，外源生長調(diào)節(jié)劑對品種典型性的影響，繼代次數(shù)和變異，增殖方式的合理選擇8花藥是器官培養(yǎng)，花粉是細胞培養(yǎng)9單倍體，具有配子體染色體數(shù)的孢子體。單倍體植物的明顯特點：體細胞染色體數(shù)減半，生長發(fā)育弱，體形小，各種器官明顯減小，雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代10花藥培養(yǎng)：外植體的選擇，供試材料的遺傳背景（最多的茄科

23、植物），材料的生育狀態(tài)（幼年植株比老齡植株花藥誘導率高），花粉的發(fā)育時期（單核中晚期到雙核早期）材料的表面消毒：未開放的花蕾取花藥用70%乙醇擦拭表面，飽和漂白粉，0.1%HgCl無菌水沖洗，)接種：平板培養(yǎng)基，MS應(yīng)用最普遍，培養(yǎng)：光照（先弱后強），溫度，植物再生，生根和移栽11花粉的培養(yǎng)花粉和小孢子培養(yǎng)取材適宜期大多數(shù)為花粉發(fā)育處于四分體到單核早期花粉的分離：機械分離法，花粉漂浮培養(yǎng)自然釋放法，磁力攪拌法花粉培養(yǎng)法：直接培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)，哺育培養(yǎng)，看護培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)，雙層培養(yǎng)影響花粉和花藥培養(yǎng)的因素：供體植物的基因型，生理狀態(tài)（大田比溫室的更適宜），花粉發(fā)育時期預(yù)處理：啟動分裂，冷處理，熱處理

24、，化學處理，其他方法低溫預(yù)處理的作用：1預(yù)處理引起花藥，花粉內(nèi)激素變化，改變了小孢子（花粉粒），第一次有絲分裂的軸向（正常發(fā)育時，兩次有絲分裂形成三核花粉粒）進而形成愈傷組織2提供小孢子的生活力，延緩?fù)嘶俣?，而提高誘導率3引起小孢子孤立化，即小孢子從花粉中分離，因為低溫處理過程中，花藥，內(nèi)薄壁細胞和絨氈層逐漸退化，從而切斷與小孢子之間的聯(lián)系4刺激花粉產(chǎn)生原胚5促使細胞同步分裂培養(yǎng)基的成分，無機鹽，碳源，激素，有機附加物，活性炭：作用，吸附瓊脂中不利于花粉細胞生長的某些雜質(zhì)，同時也可以吸附各種植物激素，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源和外源生長物質(zhì)的水平花藥壁因子，可能具有促進作用溫度和光照12花藥和花粉培養(yǎng)中單

25、倍體植株形成途徑單倍體細胞發(fā)育的方式：（1）單核小孢子起始培養(yǎng)的可能發(fā)育方式，一部分很快脫分化進行均等分裂進而形成小細胞團進入孢子體發(fā)育形成植株，另一部分繼續(xù)體內(nèi)的發(fā)育方式，在細胞內(nèi)形成大液泡，進入晚期單核小孢子。（2）二細胞花粉起始培養(yǎng)的可能發(fā)育方式，小的生殖細胞停止發(fā)育，大的營養(yǎng)細胞進入發(fā)育，然而形成孢子體；營養(yǎng)細胞停止分裂，生殖細胞進入孢子體發(fā)育；營養(yǎng)細胞和生殖細胞可能融合，由融合細胞繼續(xù)分裂形成再生植株，稱為二倍體花粉植株植株的再生途徑：通過胚胎發(fā)育途徑形成單倍體植株。通過愈傷組織形成單倍體植株13花粉植株的倍性及染色體加倍花粉植株的倍性：單倍體，二倍體，多倍體，非整倍體染色體加倍：自

26、然加倍，人工加倍（秋水仙素：組織細胞有絲分裂時紡錘絲的形成層）。愈傷組織加倍法（愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)后得到二倍體）14胚培養(yǎng)的意義和類型：意義：1克服雜交育種中雜種胚的早期夭折2克服珠心胚干擾，提高育種效率3理論領(lǐng)域的應(yīng)用類型：成熟胚培養(yǎng)，幼胚培養(yǎng) 幼胚培養(yǎng)：1取材：多為球形胚和魚雷形胚 2幼胚剝離，容易失水，注意保濕，且操作迅速，盡量帶柄 3接種培養(yǎng)，幼胚生長方式：胚性發(fā)育，早熟萌發(fā)，愈傷組織培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：蔗糖3%10%，而心形胚和魚雷胚只要去4%6%。（異性期和自養(yǎng)期），光照和溫度。15子房培養(yǎng)：包括授粉前和授粉后的培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基，植物激素的影響，蔗糖濃度單倍體來源和發(fā)育途徑：助細

27、胞或胚囊的無配子生殖產(chǎn)生單倍體；卵細胞，助細胞，反足細胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體；非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體16被子植物胚乳培養(yǎng)發(fā)育特性：核型胚乳（經(jīng)過游離階段），細胞型胚乳（沒有經(jīng)過游離階段），沼生目型胚乳倍性特點：嵌合體的普遍性，倍性不穩(wěn)定，倍性多倍化植物細胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)1植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)。培養(yǎng)規(guī)模（小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)），培養(yǎng)方式（懸浮培養(yǎng)，平板培養(yǎng)，看護培養(yǎng)），要求產(chǎn)物的不同（誘變細胞培養(yǎng)，生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)）2懸浮培養(yǎng)；單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。多采用葉肉細胞和根尖細胞作為細胞來源

28、，細胞分離方法是機械分離和酶分離愈傷組織誘導：適宜的植物外植體材料：幼胚，胚軸，子葉 適宜的培養(yǎng)基，較高濃度激素濃度，必要的附加成分 愈傷組織的要求：松散性好，增殖快，再生能力強懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)體系的三個條件：1懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30個到50個一下，2均一性，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或黃色，3細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般為2到3天甚至更短的時間便可增加一倍懸浮培養(yǎng)細胞的同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期分選法：通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周

29、期的細胞進行分選然后將同一狀態(tài)的細胞繼代培養(yǎng)與同一培養(yǎng)體系中，優(yōu)點，操作簡單，分選的細胞處于自然生長狀態(tài)，常規(guī)方法是梯度離心法饑餓法，在一個培養(yǎng)體系中，如果細胞生長的基本成分散失，則導致細胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期，當細胞處于氮饑餓其，通常獲得G1期的同步化細胞，當細胞處于磷和碳饑餓時，則可以獲得G1和G2期的同步化細胞抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，就可獲得處于同一時期G1期的同步化細胞低溫處理法：3單細胞培養(yǎng)：（1）平板培養(yǎng)，指一定密度的懸浮液細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)技術(shù)要點：植板，單細胞分離，單細胞懸

30、浮液制備平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量，是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比列看護培養(yǎng)：生長速度快，提供培養(yǎng)基所不能提供的營養(yǎng)成分，在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種與濾紙上，當培養(yǎng)細胞長出微小細胞團以后，將其轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基讓其迅速生長。微室培養(yǎng)：進行單細胞活體連續(xù)觀察而建立的單細胞培養(yǎng)技術(shù)，對單細胞分化，細胞分裂的全過程，胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律其他單細胞培養(yǎng)技術(shù)：雙層濾紙植板培養(yǎng)示意圖4植物細胞的規(guī)模培養(yǎng)：滿足的條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上是穩(wěn)定的，以得到恒定的產(chǎn)物；細胞生長基生物合成的速度快，在較短時間內(nèi)得到較高的產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)

31、物在細胞中積累而不迅速分解，最好將其釋放到培養(yǎng)基中，植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立：1種子細胞的選擇與保存，（天然器官和外植體）2種子細胞系的增殖與放大培養(yǎng)，（獲得活躍的細胞生長群體）3大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立（成批培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)體積中接種細胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。連續(xù)培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)）生物反應(yīng)器的類型和特點：1攪拌式生物反應(yīng)器：混合程度高，適應(yīng)性廣，反應(yīng)器內(nèi)溫度，PH，溶氧以及營養(yǎng)液濃度容易控制。2氣動式生物反應(yīng)器：剪切力小，結(jié)構(gòu)簡單，避免污染3固定化細胞反應(yīng)器：較容易的控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成，節(jié)省時間和費用，能

32、進行連續(xù)生產(chǎn)4光照生物反應(yīng)器：5轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器，懸浮系統(tǒng)均一，低剪切環(huán)境，供氧效率高，防止細胞粘壁，6其他類型的生物反應(yīng)器4植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)中的有關(guān)工程技術(shù)問題：培養(yǎng)中植物細胞的特性：體積大，以細胞團方式存在，抗剪切能力弱，生長速度慢培養(yǎng)液的流變特性：培養(yǎng)液的黏度是有細胞本身和細胞分泌物引起，培養(yǎng)液黏度依賴于細胞年齡，形態(tài)，細胞團大小泡沫和表面黏附性：化學和機械消泡?；瘜W消泡劑的條件：1具有較低的表面張力和一定的親水性，以使消泡劑對氣/液界面的分散系數(shù)足夠大，消泡作用迅速2化學性質(zhì)穩(wěn)定，在水中溶解度小，不與次生代謝產(chǎn)物起任何化學反應(yīng)對植物細胞無毒害，3不影響氣體在營養(yǎng)液中的傳遞和溶解4來源

33、方便，價格便宜，包括，天然油脂類，高級醇類，聚醚類，和硅酮類5植物次生代謝產(chǎn)物的主要類型：1酚類化合物：黃酮類，醌類，簡單酚類。，2萜類化合物，單，倍半，二倍半，三萜，及3含氮化合物，生物堿，胺類，非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷4其他，多炔類，和有機酸類5根據(jù)植物細胞生長和產(chǎn)物合成關(guān)系：次生代謝產(chǎn)物的類型1生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物合成與細胞生長呈正比例關(guān)系 2中間型：產(chǎn)物僅在細胞生長開始下降時才能合成，細胞對于對數(shù)生長時產(chǎn)物不合成，當細胞停止生長時，產(chǎn)物也停止合成，3非生長偶聯(lián)型，產(chǎn)物只在細胞生長停止后才能合成6提高細胞次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑：1選擇適宜的起始材料，2培養(yǎng)基成分（既要滿足細胞生物量的增長，又

34、要使細胞能合成和積累次生產(chǎn)物，增加N，P，K濃度能促進細胞生長，增加糖濃度有利于次生代謝產(chǎn)物合成3前體的利用4激發(fā)子的利用：激發(fā)子又叫誘導子，指能夠誘導植物細胞中的一個反應(yīng)，并形成自身防御的分子，生物，非生物，外源性激發(fā)因子。與激發(fā)子的種類和濃度有關(guān)。5抑制劑的使用6培養(yǎng)技術(shù)的選擇，原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物原生質(zhì)體是指除去細胞壁后，被質(zhì)膜包圍的裸露細胞2原生質(zhì)體的分離：植物細胞壁的主要成分分為纖維素，半纖維素，果膠質(zhì)，和少量蛋白質(zhì)，酶解法是現(xiàn)在最主要的原生質(zhì)體分離的方法材料的選擇：生長旺盛，生命力強，無菌試管苗葉片，培養(yǎng)細胞，生長旺盛，分散性好的愈傷組織或懸浮細胞也是制備原生質(zhì)體的良好材料，酶：纖維

35、素酶和半纖維素酶主要分別降解組成細胞壁的纖維素和半纖維素，而果膠酶主要是降解中膠層，優(yōu)點：獲得大量的原生質(zhì)體，缺點：酶抑制劑會影響活力，酶液的PH4.7到6.0溫度在25到30度滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇，山梨醇，葡萄糖，果糖，麥芽糖。原生質(zhì)體的游離：1材料的預(yù)處理：進行表面消毒，黑暗處理，低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，2酶解處理：盡可能低的酶的濃度，盡可能短的酶解時間獲得大量而且有活力的原生質(zhì)體。酶的種類，濃度，和酶解時間因材料而以。黑暗，靜止的條件下進行，光照會引起細胞膜損傷，造成原生質(zhì)體的活力下降。原生質(zhì)體的純化：漂浮法：蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，沉降界面法，甘露

36、醇，蔗糖作為滲透壓調(diào)劑劑，原生質(zhì)體活力的測定：目測法，熒光素雙醋酸酯染色法，伊凡藍染色法（只有已損傷的細胞才能攝取這種染料，而完整無損的或細胞則不能攝取這種染料，因而凡不能染色的原生質(zhì)體為有活力的。3原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)基：無機鹽，滲透壓調(diào)節(jié)劑：原則，培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。結(jié)合使用多種糖醇比單獨使用一種糖醇的效果更好。有機成分：維生素，氨基酸，有機酸，糖及糖醇激素：NAA，IAAPH，5.55.94原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)法：優(yōu)點，操作簡便，對原生質(zhì)體的傷害較小，通氣性好，代謝物易于擴散，并且易于補充新鮮培養(yǎng)基，形成細胞團或小愈傷組織也易于轉(zhuǎn)移。缺點，原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，

37、常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連的現(xiàn)象，或造成局部原生質(zhì)體密度過高，從而影響了原生質(zhì)體再生細胞的近一步生長發(fā)育，并且難以定點和跟蹤單個原生質(zhì)體的生長發(fā)育過程，固體平板法：優(yōu)點，原生質(zhì)體被彼此分開并固定位置，可以避免細胞間有害代謝產(chǎn)物的影響，并便于定點觀察，有利于跟蹤觀察單個原生質(zhì)體發(fā)育過程，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率，缺點：對操作要求較嚴格，在原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂糖培養(yǎng)基混合時溫度必須合適，太高會影響原生質(zhì)體活力，太低時培養(yǎng)基凝固較快使原生質(zhì)體分布不均勻，并且生長發(fā)育比淺層法慢。液體淺層固體平板雙層培養(yǎng)法：優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中以補充培養(yǎng)基對營養(yǎng)物的消耗，同時培養(yǎng)

38、物產(chǎn)生的有害物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收，從而更有利于培養(yǎng)物的生長，可以在下層固體培養(yǎng)基中添加一定的活性炭，可以有效的吸附培養(yǎng)物所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂及細胞團的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)基：優(yōu)點：利于通氣，大體積的液體培養(yǎng)基為了防止瓊脂糖過度破碎，可以調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓，以利于原生質(zhì)體的進一步生長和發(fā)育。5原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的優(yōu)化液體淺層培養(yǎng)期，雙層培養(yǎng)期，愈傷組織增殖期，愈傷組織過渡期，愈傷組織分化期6原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生細胞壁再生：原生質(zhì)體在表型上表現(xiàn)為體積增大，進而由原來的球形逐漸變?yōu)闄E圓形。細胞分裂和生長：培養(yǎng)2到7天，用幼苗的下胚軸和子葉，幼根，懸浮培養(yǎng)的

39、細胞和未成熟種子的子葉等材料分離的原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導分裂愈傷組織形成植株再生7影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素基因型，原生質(zhì)體來源（材料，分化程度，生長同步性），起始細胞密度（基本起始密度，培養(yǎng)基激素水平，密度與培養(yǎng)基成分完全性）第七章1植物體細胞雜交（原生質(zhì)體融合），是指不同種，屬間，甚至不同科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。2植物細胞雜交的類型：體細胞雜交，配子體細胞雜交，配子間細胞雜交，微細胞雜交。原生質(zhì)體融合的種類:對稱融合，非對稱融合，3用于使細胞核或細胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學，物理主要是采用射線處理，使細胞核失活。化學：核失活：碘乙酸，碘乙酰胺，質(zhì)失活：羅丹明6G，是一種親酯性染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程從而使 質(zhì)失活。4原生質(zhì)體融合：NaNO3融合法，多聚化合物法，高PH高鈣離子法，聚乙二醇（PEG）法PEG聚乙二醇法：優(yōu)點，融合成本低，無特殊設(shè)備，融合子產(chǎn)生的異核率較高，融合過程不受物