藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 2.體外診斷試劑校準(zhǔn)品溯源質(zhì)控品定值及不確定度研究 中國食品藥品檢定研究院

1、體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品溯源、質(zhì)控品賦值及不確定度研究黃杰非傳染病診斷試劑室中國食品藥品檢定研究院PPT大量采用了ISO17511（2015草案）和Miller教授培訓(xùn)PPT，也是學(xué)習(xí)體會報告內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本概述溯源賦值、不確定度研究互通性、一致化研究中檢院已發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2016年11月7日61個品種2017年11月1日113個品種參考品研制 生化項目：尿素尿酸總蛋白、K、Na、Cl等離子 傳染性疾病產(chǎn)品評價參考品（HBV、HCV、HIV、HPV等） 遺傳性疾病產(chǎn)品評價參考品（地貧、耳聾基因突變等） 血型檢測相關(guān)的產(chǎn)品評價參考品（免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)品） 高通量測序技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品評價參考品 測序儀

2、評價用基因組DNA參考品 外周血胎兒染色體非整倍體參考品 胚胎植入前染色體非整倍體參考品 腫瘤基因突變參考品研制 流式細(xì)胞技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品評價參考品 人淋巴細(xì)胞參考品 激素檢測相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品 -NIBSC國際協(xié)作標(biāo)定免疫試劑最多、檢測方法最全面，被采納數(shù)據(jù)最多促黃體生成素泌乳素2013201420152017C-肽游離前列腺特異性抗原總前列腺特異性抗原報告內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本概述溯源賦值、不確定度研究互通性、一致化研究術(shù)語和定義計量學(xué)溯源性metrological traceability測量結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)的值通過連續(xù)的比較鏈與一定的參考標(biāo)準(zhǔn)相聯(lián)系的屬性，參考標(biāo)準(zhǔn)通常是國家或國際標(biāo)準(zhǔn)，比較鏈中的每一步比較都

3、有給定的不確定度。參考物質(zhì)reference material，RM具有一種或多種足夠均勻和很好地確定了的特性，用以校準(zhǔn)測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)。校準(zhǔn)品calibrator校準(zhǔn)物質(zhì)calibration material其值在一個校準(zhǔn)函數(shù)中用作獨立變量的參考物質(zhì)。應(yīng)具有定值和已知的測量不確定度，其目的應(yīng)是校準(zhǔn)某一測量系統(tǒng)，從而建立此系統(tǒng)測量結(jié)果的計量學(xué)溯源性。ISO 17511(2015草案)ISO 17511(2015草案)Procedures foridentity andmass balancePrimary ReferenceMaterial(pure sub

4、stance)ReferenceMeasurementProcedurePureSubstanceCalibrator(e.g. Gravimetry)ReferenceMeasurementProcedureSecondaryReferenceMaterial(matrix)Panel ofPatientSamples(e.g. IDMS)ManufacturersInternalProceduresManufacturersProductCalibratorMedicalLaboratoryProcedurePatients SamplePatients ResultISO 17511(2

5、015草案)與ISO 17511(2003) 5.2 有一級參考測量程序和一級 5.1有原級參考測量程序和原級校準(zhǔn)校準(zhǔn)物，計量學(xué)溯源到SI的情況物情況:完整計量學(xué)溯源到SIUA項目的量值溯源圖校準(zhǔn)賦值物質(zhì)程序?qū)嵤┎淮_定度SI單位ID/GC/MS法多家參考實驗室SRM 913a選定方法(AACC 1982)參考實驗室參考實驗室計量學(xué)溯源校準(zhǔn)品（-70保存）廠家常規(guī)測量程序多項生化校準(zhǔn)品常規(guī)樣本用戶常規(guī)測量程序用戶結(jié)果鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、氯復(fù)合電解質(zhì)冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品聯(lián)合賦值單位鋰鈉鉀鎂鈣氯A 離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法同位素稀釋電感耦合等離子 離子色

6、譜法體質(zhì)譜法B/CD/離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法 離子色譜法原子吸收法 原子吸收法 原子吸收法 原子吸收法/ISO 17511(2015草案)與ISO 17511(2003) 5.2有原級參考物質(zhì)和參考測量程序(被測量由參考測量程序定義)并計量學(xué)溯源到SI的情況，如HbA1C 5.3有國際約定參考測量程序（非一級）和國際約定校準(zhǔn)物，未計量學(xué)溯源到SIISO 17511(2015草案)與ISO 17511(2003)5.3 沒有原級校準(zhǔn)物,但有參考測量程序(它定義被測量)并計量學(xué)溯源到SI的情況 5.4 有國際約定參考測量程序（非一級）但無國際約定校準(zhǔn)物，未計量學(xué)溯源到SI的情況酶類,

7、凝血因子參考測量程序二級參考物質(zhì)(基質(zhì))病人樣本盤生產(chǎn)商的內(nèi)部程序生產(chǎn)商的產(chǎn)品校準(zhǔn)品醫(yī)學(xué)實驗室程序病人樣本病人結(jié)果ISO 17511(2015草案)與ISO 17511(2003)5.5 有國際約定校準(zhǔn)物（非一級），但無國際約定參考測量程序，未計量學(xué)溯源到SI的情況5.4 有符合ISO15194國際約定校準(zhǔn)物,它定義被測量;無國際約定參考測量程序和原級校準(zhǔn)品,未計量學(xué)溯源到SI的情況ISO 17511(2015草案) 5.5 有國際一致化方案支持的國際約定校準(zhǔn)物;無國際約定參考物質(zhì)和參考測量程序，未計量溯源到SI的情況當(dāng)沒有參考測量程序時溯源中止參考物質(zhì)(基質(zhì))生產(chǎn)商內(nèi)部程序生產(chǎn)商的產(chǎn)品校準(zhǔn)品

8、醫(yī)學(xué)實驗室程序病人樣本病人結(jié)果必須賦一個值生產(chǎn)商內(nèi)部程序醫(yī)學(xué)實驗室程序生產(chǎn)商的產(chǎn)品校準(zhǔn)品病人樣本病人結(jié)果當(dāng)沒有參考測量程序時的賦值 任意設(shè)定的單位, e.g. U/L 使用一個指定的對比程序 使用所有程序的截尾均值通過公認(rèn)的程序賦值是恰當(dāng)?shù)?實際濃度是未知的 通過追溯校準(zhǔn)值至參考物質(zhì)的值可以實現(xiàn)協(xié)調(diào)一致 可使用臨床指南通過公認(rèn)程序賦值的局限性所有測量程序應(yīng)可追溯到同一參考物質(zhì) 若有多家參考物質(zhì)供應(yīng)商，非等效性賦值的風(fēng)險將被分配給參考物質(zhì) 因此，存在導(dǎo)致臨床樣本結(jié)果不一致的風(fēng)險ISO 17511(2015草案)與ISO 17511(20035.6.被測量只溯源到制造者內(nèi)部確定/具有的校準(zhǔn)物;無原

9、級校準(zhǔn)物或參考程序;未計量溯源到SI的情況有制造商選定的測量程序，但既無國際約定參考測量5.6程序，也無國際約定校準(zhǔn)物，未計量學(xué)溯源到SI的情況必須賦一個值生產(chǎn)商內(nèi)部程序醫(yī)學(xué)實驗室程序生產(chǎn)商的產(chǎn)品校準(zhǔn)品病人樣本病人結(jié)果dPCR技術(shù)的溯源報告內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本概述溯源賦值、不確定度研究互通性、一致化研究常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備路線均勻性評價穩(wěn)定性評價參考物質(zhì)樣本來源細(xì)胞模擬微球血漿分泌物血清樣本細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA片段化DNA組織病毒株CLSI C37可互換的冷凍人血清池 分裝 冷凍-70C個體樣本不適用室溫下凝結(jié)3-4 小時使用剩余臨床樣本制備參考物質(zhì)剩余臨床樣本去除分子添加分析物添加防腐劑混合，過濾

10、冷凍的個體樣本解凍，混合，溶解，過濾分裝并保存凍干或冷凍修改的C37指南：使用混合血樣制備參考物質(zhì)去除分子添加分析物添加防腐劑C37 方案混合，過濾分裝并保存凍干或冷凍以血清為基質(zhì)的參考物質(zhì)添加小分子收集經(jīng)抗凝的血液血清蛋白基質(zhì)過濾，分裝添加生物分子（人源或非人源）離心冷凍血漿解凍血漿添加防腐劑以液體，冰凍狀或凍干狀態(tài)儲存通過添加鈣離子和凝血酶轉(zhuǎn)換成血清離心，透析，濃縮恢復(fù)血清蛋白基質(zhì)Miller, et.al. Clin Chem 2011;57:1670-80.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備生產(chǎn)制備凍干賦型劑1#、5#、7#和9#瓶子里為F公司FSH抗原，稀釋液中甘露醇濃度分別為1%、2%、5%和10%2

11、#、6#、8#和10#瓶子里為M公司FSH抗原，稀釋液中甘露醇濃度分別為1%、2%、5%和10%單克隆抗體類國家標(biāo)準(zhǔn)品賦形劑配方配方1（原配方）配方2配方4配方3成分每L含量蔗糖海藻糖乳糖50g100g50g50g/50g/50g激素類國家標(biāo)準(zhǔn)品賦形劑配方配方9（原配方） 配方2（10） 配方3（11） 配方4（12）成分每L含量1g人血清白蛋白1g5g1g50g乳糖10g10g20g0.63g甲酸銨0.63g0.63g0.63gC-P凍干賦形劑的選擇稀釋基質(zhì)配制基質(zhì)各廠家稀釋標(biāo)示123301526.0213.036.553.431.800.9526.2812.916.563.421.790.

12、9429.9414.947.533.842.011.1223.6111.976.063.121.650.8925.7414.487.283.341.650.8423.8512.916.363.141.630.8去激素人血清，200ng/ml7.53.751.8750.937530157.5緩沖稀釋液，200ng/ml3.751.8750.9375儲存條件配制基質(zhì)對照（-20）37 10d信號值室溫4h信號值標(biāo)示信號值濃度值39.8243.4216.5716.157.66濃度值50.4643.8416.7516.677.45濃度值38.5240.5016.1516.887.74210052170

13、2150137331466495351445192748151702722301313521554993914754928014716963379319023208084646211043379144477679148180812823355697968112833674633334023381196070812124549413919530157.5去激素人血清，200ng/ml811537097.63796353417.487.49346795243.76355898613.833.683.75347826833.76355079953.823.66123039471.9512571388

14、1.981.921.8750.937530128343052.00122935751.951.9442117561.0640588371.041.051.054310620198200689202061484143631775145411185780300327674225433281636331281661182974611587350393197137635071.0832.8834.9215.9816.337.337.213.653.641.911.891.021.00417226620452295720279948513526695813766201273522700749095543

15、1483801310289081085398310822649371219634697891.0636.3235.3314.4814.896.927.043.513.481.821.810.990.954154897186233691 27.57196385090 31.98125335778 12.90127167265 13.17156438921064276122270842622676662088258888838797296544728623456.126.113.173.151.611.620.870.85C-P緩沖稀釋液，200ng/ml7.53.751.8750.9375基本要

16、求CNAS-GL29標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法ISO Guide 35:2006電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合賦值電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合賦值 每個項目每次依次分別測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-質(zhì)控物質(zhì)-3個濃度待定值冰凍血清樣本。每次每個樣本至少測定6個有效數(shù)據(jù) 按表14中所列標(biāo)準(zhǔn)判定檢測數(shù)據(jù)是否有效，不符合表14所列要求的無效實驗室數(shù)據(jù)將被剔除，有效的實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果計算 將驗證有效的數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理：全部實驗室每批次數(shù)據(jù)的均值再取均值作為該定值樣本的靶值電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合賦值電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合賦值A(chǔ)FP協(xié)作標(biāo)定結(jié)果廠家（簡稱）效價比1.0281.1101.0331.0600.8881.0400.8311.

17、1401.1021.1181.0911.040930安圖新產(chǎn)業(yè)科華艾康達(dá)瑞西門子（Centaur）西門子（IMMULITE）貝克曼羅氏索靈希森美康平均免疫活性/安瓿（IU）最終定AFP國家標(biāo)準(zhǔn)品候選品免疫活性為930IU/支（即1125ng/支）打印標(biāo)簽理論結(jié)果1234p.Lys1183Arg；p.Asp435Tyr；p.Asn1784ThrfsBRCA1:K1183R_1BRCA2:V2466A_2BRCA1:R1443STOP_3正確正確正確錯誤錯誤錯誤錯誤正確錯誤錯誤正確正確p.Val2466Ala；p.Ile2675Hisfsp.Arg1443Ter；p.Asn1784Thrfs；p.

18、Lys1691AsnfsBRCA2:p.T3030fs_4BRCA1:K1780_splic_5BRCA2:p.T582P_6p.Thr3033Leufs；p.Asn810Thrc.5277+1GA正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確錯誤正確正確正確正確正確正確正確正確p.Thr582ProBRCA2:p.R2318*_7p.Arg2318TerBRCA2:p.T3357R_8p.Thr3357ArgBRCA1:c.981_982delAT_9BRCA2:c.5718_5719delCT_10BRCA2:c.3109CT_

19、11BRCA1:c.3333_3333del A_12p.Cys328Terfsp.Leu1908Argfsp.Gln1037Terp.Glu1112AsnfsBRCA2:c.5171delT (p.Ile1724Lysfs) _13p.Ile1724Lysfsp.Tyr3092Cysfs正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確錯誤正確正確正確正確正確錯誤正確正確正確BRCA2:c.9274_9277delTATT(p.Tyr3092Cysfs) _14BRCA2:c.6445_6446delAT(p.Ile2149Terfs)_15p.Ile2149Terfs；p.Met18

20、Valp.Gln1295TerBRCA2:c.3883CT（p.Gln1295Ter）_16BRCA1:c.5470_5477delATTGGGCA(p.Ile1824Aspfs) _17p.Ile1824AspfsBRCA1:c.3800TG(p.Leu1267Ter) _18p.Leu1267TerBRCA:正常_19benign正確錯誤正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確正確BRCA2：c.988delA_20BRCA1:c.5156delT_21BRCA2:c.275dupA_22BRCA1:c.4013delA_23BRCA1:c.68

21、_69delCT_24p.Ile332Phefsp.Val1719Glyfsp.Ser93Ilefp.Lys1338Argfsp.Glu23Valfs;BRCA2:21-27號外顯子雜合缺失_25EX21_27 Del正確擴(kuò)增子方法不適用擴(kuò)增子方法不適用正確腫瘤基因突變檢測國家參考品研制捕獲原理擴(kuò)增原理life平臺（NGS）illumina平臺（NGS）BGI平臺突變頻率定值Bio-rad平臺（ddPCR）平臺（NGS）Thermo（ddPCR）腫瘤基因檢測國家參考品研制EGFR/ALK/MET國家參考品盤MutationEGFR G719S陽性參考品1-EGFR-G719S-24%2-EGF

22、R-G719A-48%3-EGFR-G719C-20%4-EGFR-L858R-22%5-EGFR-L861Q-13%5%檢測限參考品18-EGFR-G719S-5%19-EGFR-G719A-5%20-EGFR-G719C-5%21-EGFR-L858R-5%22-EGFR-L861Q-5%23-EGFR-T790M-5%24-EGFR-S768I-5%2.5%檢測限參考品37-EGFR-G719S-2.5%38-EGFR-G719A-2.5%39-EGFR-G719C-2.5%40-EGFR-L858R-2.5%41-EGFR-L861Q-2.5%42-EGFR-T790M-2.5%43-

23、EGFR-S768I-2.5%濃度（ng/l）體積(l) 樣本類型1010101010101012121212121212DNADNADNADNADNADNADNAEGFR G719AEGFR G719CEGFR L858REGFR L861QEGFR T790MEGFR S768I6-EGFR-S768I-9%7-EGFR-E746_A750-50%（COSM6225）EGFR E746-A750COSM622525-EGFR-E746_A750-5%（COSM6225）44-EGFR-E746_A750-2.5%（COSM6225）1012DNAEGFR E746-A750COSM6223

24、26-EGFR-E746_A750-5%（COSM6223）45-EGFR-E746_A750-2.5%（COSM6223）8-EGFR-E746_A750-45%（COSM6223）10101212DNADNAEGFR L747_T751EGFR E746_T751AEGFR E747_T753SEGFR L747_A750P9-EGFR-L747_T751-10%10-EGFR-L746_T751A-6%11-EGFR-E747_T753S-39%12-EGFR-L747_A750P-28%27-EGFR-L747_T751-5%46-EGFR-L747_T751-2.5%28-EGFR-

25、L746_T751A-5%29-EGFR-E747_T753S-5%30-EGFR-L747_A750P-5%47-EGFR-L746_T751A-2.5%48-EGFR-E747_T753S-2.5%49-EGFR-L747_A750P-2.5%101010121212DNADNADNAEGFR E746_S752VMET擴(kuò)增13-EGFR-E746_S752V-65%14-MET擴(kuò)增-14拷貝15-ALK（E13-A20）-18%16-ALK（E6-A20）-8%31-EGFR-E746_S752V-5%32-MET擴(kuò)增-4拷貝50-EGFR-E746_S752V-2.5%10121212

26、1212DNADNADNADNADNA10ALK（E13-A20）ALK（E6-A20）ALK（E14-A20）Mutation33-ALK（E13-A20）-5%34-ALK（E6-A20）-5%35-ALK（E14-A20）-5%檢測限參考品51-ALK（E13-A20）-2.5%52-ALK（E6-A20）-2.5%53-ALK（E14-A20）-2.5%檢測限參考品101010陽性參考品濃度（ng/l）體積(l) 樣本類型ALK（E13-A20）54-ALK（E13-A20）-100拷貝/30ng101212RNARNAALK（E20-A20）Mutation陰性17-ALK（E20-

27、A20）-500拷貝/30ng陰性參考品36-ALK（E20-A20）-400拷貝/30ng55-ALK（E20-A20）-100拷貝/30ng10濃度（ng/l）體積(l) 樣本類型56-陰性-1101010101010121212121212RNADNADNADNADNADNA陰性57-陰性-1陰性58-陰性-2陰性59-陰性-3陰性60-陰性-4陰性61-陰性-5腫瘤基因檢測國家參考品研制SNV檢測結(jié)果 （TE+野生型稀釋/DNA樣本）NGSddPCRMutationCOSMIC IDddPCR Ave AF（bio-rad）ddPCR Ave AF（thermo）均值illum Ave

28、 AFlife Ave AFBGI Ave AFBRAF V600E(T)EGFR G719AEGFR L861QKRAS G12V(T)KRAS Q61HCOSM476COSM6239COSM6213COSM520COSM554COSM763COSM775COSM521COSM520COSM516COSM522COSM522COSM532COSM554COSM583COSM775COSM625325.83%41.40%13.40%17.18%14.49%16.00%17.47%17.10%9.51%29.65%56.12%13.68%18.72%17.05%18.23%23.18%28.56

29、%27.18%21.25%24.63%68.52%39.03%14.29%54.44%30.53%29.93%22.88%45.01%13.37%17.01%14.96%15.63%17.84%16.12%9.38%19.60%47.60%13.23%19.73%22.03%49.36%11.59%19.39%16.66%18.54%21.98%26.41%21.83%19.58%21.62%67.05%32.86%14.54%24.00%47.90%13.05%18.41%15.79%17.51%20.12%16.61%9.45%PI3KCA E545KPI3KCA H1047RKRAS G

30、12D19.17%27.23%21.50%19.37%18.70%64.17%34.70%KRAS G12V(T)KRAS G12C14.90%9.89%12.62%11.39%34.85%12.85%3.85%13.76%10.64%33.23%13.24%3.52%KRAS G12AKRAS G12A31.61%13.63%3.20%KRAS G13DKRAS Q61HNRAS Q61L26.18%12.03%17.56%23.00%11.98%20.42%24.59%12.00%20.59%PI3KCA H1047REGFR G719C23.83%23.79%工作校準(zhǔn)品的賦值-參考血清組

31、參考血清組的準(zhǔn)備 要求5個梯度的新鮮混合血清組，血清中的分析物濃度盡可能分布于整個相應(yīng)的檢測范圍內(nèi)，分裝后冰凍于-70。定期檢查其穩(wěn)定性，混合血清的參考值最多被認(rèn)可6個月，需要重新用于參考標(biāo)準(zhǔn)化時，應(yīng)重新測定。工作校準(zhǔn)品的賦值-參考血清組參考實驗室的選擇 運行參考方法的參考實驗室應(yīng)滿足以下條件：（1）參考實驗室應(yīng)采用JCTLM推薦的參考方法，參考實驗室的環(huán)境條件應(yīng)符合相應(yīng)的國標(biāo)規(guī)定。（2）應(yīng)定期參加IFCC組織的RELA國際室間質(zhì)評計劃，且評價結(jié)果比較理想。工作校準(zhǔn)品的賦值-參考血清組 參考方法的驗證用參考方法對血清定值前，首先要進(jìn)行參考方法的準(zhǔn)確度驗證。參考實驗室用JCTLM推薦的參考方法連

32、續(xù)測量CRM不少于3次，若每次測量值均在靶值擴(kuò)展不確定度（k=2）范圍內(nèi)，并且CV1%，則說明該室參考方法測量準(zhǔn)確度良好。若測量值在靶值擴(kuò)展不確定度（k=2）以外或CV1% ，則需檢查原因，直至符合該要求為止。工作校準(zhǔn)品的賦值-參考血清組 新鮮混合血清組的定值建議每個參考實驗室用參考方法對新鮮混合血清組進(jìn)行3個批次測量，每個批次測量次數(shù)不少于5次，測量次數(shù)不少于15次。樣本測定前后均需進(jìn)行質(zhì)控物質(zhì)的測量。所有參考實驗室測量均值的未加權(quán)平均數(shù)即為該參考血清的定值。工作校準(zhǔn)品的賦值-不確定度評定 參考血清組的不確定度評定測量不確定度過程按照CNAS-GL06化學(xué)分析中不確定度的評估指南步驟：將現(xiàn)有

33、鑒定不確定度來源數(shù)據(jù)所能包括的分量分組轉(zhuǎn)化分量為標(biāo)準(zhǔn)差合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算擴(kuò)展不確定度規(guī)定被測量按組量化分量不確定度的主要來源：實驗室間復(fù)現(xiàn)性、參考血清均勻性、參考血清穩(wěn)定性工作校準(zhǔn)品的賦值-不確定度評定 A類評定 B類評定參考血清組的均勻性和穩(wěn)定性按照CNAS-GL29標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法進(jìn)行不確定度評定。 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 擴(kuò)展不確定度(k=2, 95%的置信水平）工作校準(zhǔn)品的賦值-實驗設(shè)計3臺同品牌儀器同一批工作校準(zhǔn)品同一批試劑5次獨立批次5次重復(fù)測定1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 5離群值檢

34、查所有運行批次有效的平均值工作校準(zhǔn)品的賦值參考系統(tǒng)新鮮血清常規(guī)系統(tǒng)常規(guī)結(jié)果參考結(jié)果方法學(xué)比對工作校準(zhǔn)品的賦值1. 賦值2. 校準(zhǔn)參考方法常規(guī)方法工作校準(zhǔn)品3. 測定4. 測定參考血清組常規(guī)結(jié)果5. 方法學(xué)比對、調(diào)值參考結(jié)果工作校準(zhǔn)品定值判斷標(biāo)準(zhǔn)：R20.99, a = 1.00 0.02，b 0工作校準(zhǔn)品的賦值采用選定的檢測系統(tǒng)和具有初步賦值的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)品初步賦值為309.9通過方法學(xué)比較發(fā)現(xiàn)斜率不符合相關(guān)規(guī)定。通過回歸方程調(diào)整校準(zhǔn)品的值為331.9，重新檢測。通過方法學(xué)比較，滿足相關(guān)規(guī)定要求。確定校準(zhǔn)品的值為331.9。工作校準(zhǔn)品的賦值-不確定度的評定 A類評定 B類評定均勻性和穩(wěn)定性按照C

35、NAS-GL29標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法進(jìn)行不確定度評定。工作校準(zhǔn)品的賦值-不確定度的評定 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 擴(kuò)展不確定度(k=2）產(chǎn)品校準(zhǔn)品的賦值-實驗設(shè)計4個同品牌儀器同一批工作校準(zhǔn)品同一批試劑7次獨立批次7次重復(fù)測定1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7離群值檢查所有運行批次有效的平均值產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-均勻性檢查多項生化校準(zhǔn)品-LDH賦值 隨機(jī)抽取15個樣品，每個樣品重復(fù)測定3次，分析如下：方差分析結(jié)果-LDH差異源組間SSdfMSFP-valu

36、e0.0095F crit2.037235.56182.51418.0714 16.8262.77組內(nèi)30446.084總計方差分析結(jié)果F值為2.77小于10，產(chǎn)品校準(zhǔn)品LDH瓶間均一性較好，符合賦值要求。產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值 每天按如下順序進(jìn)行測定： 測定兩個水平質(zhì)控（MK1, MK2)各3次，測定上一批校準(zhǔn)品（CO）、待賦值校準(zhǔn)品（CN）、兩個水平混合血清(P1, P2)各7次，測定兩個水平質(zhì)控品(MK1, MK2)各4次。產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-離群值檢查 離群值檢查儀器01儀器02儀器03儀器04質(zhì)控水平1（MK1）質(zhì)控水平2（MK2）上一批校準(zhǔn)品（CO）產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-離群值檢查儀器01儀器02儀

37、器03儀器04待賦值校準(zhǔn)品（CN）混合血清水平1（P1）混合血清水平2（P2）產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-精密度評價 重復(fù)性 Verror MSSRerrorMSDay MSS V Verror MSerrorWLdayerrornrep 儀器內(nèi)精密度MS MS MS MSS V V VsitedayDayerror MSerrorREPsitedayerrorn nnrepdayrep 復(fù)現(xiàn)性產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-精密度評價重復(fù)性儀器內(nèi)精密度復(fù)現(xiàn)性平均值(U/L)SDCV%3.5%1.7%2.5%1.8%2.7%1.3%SDCV%SDCV%3.9%2.0%2.6%2.1%3.1%1.6%樣本MK1MK2COC

38、N184.8369.0330.3322.7217.6568.66.386.458.405.905.907.586.047.128.106.506.508.903.3%1.9%2.5%2.0%3.0%1.6%7.237.368.556.736.739.35P1P2產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-精密度評價產(chǎn)品校準(zhǔn)品的賦值-不確定度評定 A類評定A類評定主要指由測量產(chǎn)品校準(zhǔn)品而生成的不確定度（uchar）。根據(jù)ISO Guide 35，計算以多個儀器測量產(chǎn)品校準(zhǔn)品時產(chǎn)生的測量不確定度，其公式：sREPucharn式中：uchar 測量工作校準(zhǔn)品時，產(chǎn)生的不確定度SREP 復(fù)現(xiàn)性n 儀器數(shù)產(chǎn)品校準(zhǔn)品不確定度計算 A

39、類評定差異源天間儀器誤差總計SSdfMSFP-valueF crit4183.439693.09165013.7389890.26948387.15498231.030534.817632.5031866.6354481.49E-050.0003141.4459252.667443144195sS V V Vsite day error6.73REPu 3.365REPMS MS MS MScharn4sitedayDayerror MSerrorn nnrepdayrep231.0387.15 87.1534.82 34.82 6.73777產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定 工作校準(zhǔn)品的不確定度

40、 均勻性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 穩(wěn)定性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定均勻性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度MS瓶間 MS瓶內(nèi)u s n0bbbb 式中：n 為有效測量次數(shù), n =3。0016.826 6.084u 1.892bb3產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定長期穩(wěn)定性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度n X X Y Yii 46.494b1 i1n 0.151308 2X Xii1式中：Y 322.12X 308截距由下式計算：b Y b X 322.12 (0.151308) 323.3301產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定 直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由下式計算：nY b b x)2(i01i144 .665s2 28

41、.93i 1n 2l 取其平方根s=5.379 U/L，斜率的不確定度用下式計算：s5.379308s(b1) 0.3165n(Xi X )i1產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定 自由度為n-2和p=0.95（95%置信水平）的學(xué)生分布t因子等于2.015。 由于l 故斜率是不顯著的。因而未觀測到不穩(wěn)定性。l 有效期t=20個月的長期穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)即成為：s s t 0.316520 6.330U / Ltb產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度類別值ucharum-calubbultsusts3.3659.131.8926.3300u u2 u2 u2 u2 u 2ccharmcalb

42、bltssts2 3.365 9.13 1.892 6.330 02 2 2 11.76 選定的運輸條件無需考慮運輸不穩(wěn)定性造成的附加不確定度， 因此usts0產(chǎn)品校準(zhǔn)品賦值-不確定度評定儀器儀器01 儀器02325.3 323.1儀器03儀器04賦值結(jié)果(U/L)平均值(U/L)322.0320.1322.7擴(kuò)展不確定度(U)U= uc2 = 11.762=23.52 U/L因此,產(chǎn)品校準(zhǔn)品MKD(批號160803) LDH項目在日立系列全自動生化分析儀上的賦值為322.723.52 U/L(k=2)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性要求4.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗4.1.1 均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，它是用來

43、描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性空間分布特征的。4.1.2 均勻性初檢 對特性量不易均勻的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在制備過程中除采取必要的均勻措施外，還應(yīng)進(jìn)行均勻性初檢。4.1.3 均勻性檢驗不論制備過程中是否經(jīng)過均勻性初檢，凡成批制備并分裝成最小包裝單元的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，必須進(jìn)行均勻性檢驗。對于分級分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),凡由大包裝分裝成最小包裝單元時,都需要進(jìn)行均勻性檢驗；檢驗的目的是來判定單元間的變動性在統(tǒng)計學(xué)上是否顯著。4.1.6 均勻性檢驗方法的選擇應(yīng)選擇有代表性的和不容易均勻的待測特性量值進(jìn)行均勻性檢驗，選擇不低于定值方法的精密度和具有足夠靈敏度的測量方法，在重復(fù)性的實驗條件下做均勻性檢驗。均勻性檢驗并不要求給出特性量值，只

44、是檢驗該特性量值的分布差異。4.1.7 均勻性檢驗結(jié)果的評價原則上通過統(tǒng)計學(xué)處理評價是否顯著，用以檢驗單元內(nèi)的均勻性；均勻性分析取樣方式分裝的初始，中間，終結(jié)階段取樣取樣數(shù)目若計總體單元數(shù)為N，當(dāng)總體單元數(shù)N1000時，抽取樣品數(shù)不少于30個。對于均勻性好的樣品，當(dāng)N500時，抽取單元數(shù)不少于15個。候選品分裝數(shù)量為1900支/水平。因此每個水平分別抽取30支檢查瓶間均勻性樣本測定采用精密度良好的日立7180全自動生化分析儀進(jìn)行測定，每個樣本測定3次統(tǒng)計方法單因素方差分析均勻性三水平的F值均小于F臨界值，說明瓶間無顯著性差異TSH均勻性分析結(jié)果準(zhǔn)確性樣品斜率截距相關(guān)系數(shù)t0.05（9）效價比t

45、0.94960.93830.92820.90010.93000.92734.45394.43964.39774.49494.47264.49870.99980.99980.99980.99930.99960.9992國際標(biāo)準(zhǔn)品候選品1候選品2候選品3候選品42.4472.4472.4472.4472.4470.93690.82330.96890.99271.05100.6801.3572.1210.9810.924候選品50.97770.91670.95314.38304.50124.41030.99920.99940.99992.4472.4472.4470.91321.02720.9086

46、1.1231.4840.247候選品6候選品7候選品8瓶間變異系數(shù)（CV）為7.7%標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性要求4.2.3穩(wěn)定性檢驗方法的選擇選擇不低于定值方法的精密度和具有足夠靈敏度的測量方法進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗，并注意保持與定值時操作及實驗條件的一致。穩(wěn)定性檢驗可以通過不同溫度的加速穩(wěn)定性以及實時穩(wěn)定性進(jìn)行。4.2.4穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)結(jié)果判斷及有效期限的確定按時間順序進(jìn)行的測量結(jié)果在測量方法的不確定度范圍內(nèi)波動，則認(rèn)為該特性量值在試驗的時間間隔內(nèi)是穩(wěn)定的,該時間間隔可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期,據(jù)此給出有效期限;若測量結(jié)果的變化大于測量方法的不確定度或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的預(yù)期不確定度，則穩(wěn)定性檢驗結(jié)果不合格或?qū)⒆儎有詭淼?/p>

47、不確定度統(tǒng)計到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總的不確定度內(nèi)；有效期限的確定可以通過加速穩(wěn)定性進(jìn)行初步估算，采取實時穩(wěn)定性檢測盒期間核查的方式最終確定有效期限。4.3期間核查在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)放期間要不斷積累穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，以延長有效期，并通過期間核查進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察。期間核查方法應(yīng)選擇不低于定值方法的精密度和具有足夠靈敏度的測量方法。期間核查的間隔根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性由研制人員確定。穩(wěn)定性取樣方式及取樣數(shù)目在第1、2、3、5、7、12、20、30天8個時間點上，隨機(jī)抽取，分別放在室溫（20-25）、（2-8）、-20三種溫度條件下，每個溫度每個水平樣本各3支，同一天內(nèi)測定樣本測定采用精密度良好的日立7180全自動生化分析儀

48、測定，每個樣本測定3次統(tǒng)計方法一元線性回歸分析穩(wěn)定性TSH穩(wěn)定性分析結(jié)果理論濃度稀釋倍數(shù)8周7周6周5周4周3周0周5700175705.1119.0244.9186.7831706.0120.0146.1788.7435115.5019.7246.9490.1234364.6218.3544.9083.3831276.0521.9349.4893.2037005.1919.2444.1089.4933054.8720.4747.3794.143401/205010035返算濃度（IU/ml）相對偏差（%）-6.8%3.2%1.0%-8.1%8.8%-2.8%37放置3W、4W、5W、6W、7

49、W、8W后，與-20保存的標(biāo)準(zhǔn)品候選品（作為0周）的相對偏差絕對值在1.0%8.8%之間報告內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本概述溯源賦值、不確定度研究互通性、一致化研究標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性 互通性/互換性n 對于給定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的規(guī)定量，由兩個給定測量程序所得測量結(jié)果之間關(guān)系與另一個指定物質(zhì)所得測量結(jié)果之間關(guān)系一致程度表示的參考物質(zhì)特性。（ISO/IEC Guide 99:2007, 5.15）解釋：互換性是指參考物質(zhì)的理化性質(zhì)與實際被測樣品（天然樣本）在二個測量程序間測量特性的接近程度與參考物質(zhì)的制備有關(guān)使用具有互換性物質(zhì)的進(jìn)行校準(zhǔn)1086與患者樣本的檢測結(jié)果具有等效性420臨床樣本參考物質(zhì)作為校準(zhǔn)品0246810測量

50、程序1使用非互換性物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)1086與患者樣本的結(jié)果不同42臨床樣本參考物質(zhì)作為校準(zhǔn)品00246810測量程序1對于大多數(shù)測量程序，肌酐是標(biāo)準(zhǔn)化的18139420032011表格源自: Killeen et al. Arch Pathol Lab Med 2013;137:496-502.美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院分析證書標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)冷凍人血清中的肌酐互換性研究肌酐參考物質(zhì)的的互換性研究2006年，NKDEP的實驗室工作組（LWG）在美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）的支持下進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（SRM）967的互換性研究，針對于當(dāng)時常見的市售可用的檢測方法，確保該參考物質(zhì)與天然血清樣本具有互

51、換性。參考物質(zhì)通常被用于建立或驗證常規(guī)測量程序至較高級別的參考測量程序的校準(zhǔn)追溯性。當(dāng)一種參考物質(zhì)被用于評估常規(guī)的臨床方法，參考物質(zhì)的互換性必須對該參考物質(zhì)預(yù)期使用的所有常規(guī)方法進(jìn)行驗證。結(jié)果NIST新鮮冷凍的肌酐參考物質(zhì),SRM967（即2006年美國病理學(xué)家學(xué)會的準(zhǔn)確性校準(zhǔn)驗證/線性調(diào)查LN24所用的物質(zhì)）與經(jīng)下列的生產(chǎn)商的試劑和儀器檢測的天然臨床血清樣本具有可互換性。參考物質(zhì)和臨床樣本是在規(guī)定的分析系統(tǒng)上以及按照NIST的LC/IDMS參考測量程序進(jìn)行測量評估的。采用臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會（CLSI）文檔EP14-A2中的標(biāo)準(zhǔn)評估互換性。CAP認(rèn)證中的準(zhǔn)確性結(jié)果：基于肌酐調(diào)查使用獲得美國病

52、理學(xué)家學(xué)會允許(2016)分析證書人血清質(zhì)量濃度重組物質(zhì)中的蛋白質(zhì)CAP PT 調(diào)查方法間CV的改善：校準(zhǔn)可溯源至ERM-DA470和不可溯源至ERM-DA470的方法校準(zhǔn)不能溯源到ERMDA470校準(zhǔn)可溯源到ERMDA470Johnson, et al. Arch Pathol Lab Med 2000;124:1496-1501參考物質(zhì)用作校準(zhǔn)品時互換性的重要性：以血漿銅藍(lán)蛋白為例結(jié)論：ERM-DA470中的銅藍(lán)蛋白是有完整文獻(xiàn)支持的典型范例，該范例說明當(dāng)缺少互換性時，使用通用材料作為校準(zhǔn)品無法實現(xiàn)檢測方法間的一致性的。血漿銅藍(lán)蛋白:參考物質(zhì)互換性評估非互換的互換的當(dāng)前評價互換性方法CLS

53、I:C37-A (1999年) 可互換的冷凍人血清池的制備及驗證EP14-A3 (2014年) 經(jīng)處理樣本的互換性評估(第一版2001年)EP30-A (2010年) 有互換性的參考物質(zhì)的特征和評價CLSI EP14, EP3050403020100Deming回歸線95% 預(yù)測區(qū)間可互換的可互換的非互換的天然臨床樣本參考物質(zhì)05101520253035404550測量程序結(jié)果1 結(jié)果CLSI EP14, EP3050403020100Deming 回歸線95% Prediction Interval在決定水平附近的不確定度不考慮天然臨床樣本參考物質(zhì)05101520253035404550測量

54、程序1 結(jié)果CLSI EP14, EP3050403020100Deming 回歸線95% 預(yù)測區(qū)間過多的相關(guān)性離散會使參考品不再具有互換性天然臨床樣本參考物質(zhì)05101520253035404550測量程序1 結(jié)果在互換性評估中的臨床樣本的合格性1. 不應(yīng)當(dāng)包含非常見的干擾物質(zhì)或?qū)⒂绊懘蠖鄶?shù)測量程序的分析物形式2. 必須覆蓋參考物質(zhì)的濃度3. 優(yōu)先選擇單份樣本4. 可能需要混合的樣本來滿足樣本量的要求-混合樣本必須經(jīng)過驗證5. 必須驗證制備和儲存條件偏差的差異性評估1. 評估兩個測量程序?qū)Σ∪藰颖竞蛥⒖嘉镔|(zhì)檢測的平均偏差2. 計算參考物質(zhì)和患者樣本檢測平均偏差的差異3. 基于測量隨機(jī)誤差，評

55、估平均偏差的差異的不確定度4. 評估平均偏差對比固定標(biāo)準(zhǔn)的差異，該固定標(biāo)準(zhǔn)用于反映參考物質(zhì)的預(yù)期用途平均偏差與固定標(biāo)準(zhǔn)的差異RM的均值 偏差差異的不確定度0.70.60.50.40.30.20.10.0-0. 1-0. 2標(biāo)準(zhǔn)臨床樣本的均值標(biāo)準(zhǔn)偏差RM1RM2 RM310RM4100RM511000平均濃度( x+z) / 2平均偏差與固定標(biāo)準(zhǔn)的差異3530252015105互通的: 偏差加不確定度在標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)臨床樣本的均值0標(biāo)準(zhǔn)-5AB CDE-10050100150200250300Mean Concentration ( x+y) / 2平均偏差與固定標(biāo)準(zhǔn)的差異非互通的: 偏差加不確定

56、度超過標(biāo)準(zhǔn)22015105標(biāo)準(zhǔn)臨床樣本的均值0標(biāo)準(zhǔn)-5AB CDE-10050100150200250300Mean Concentration ( x+y) / 2平均偏差與固定標(biāo)準(zhǔn)的差異不確定的: 標(biāo)準(zhǔn)加不確定度與標(biāo)度有重疊252015105標(biāo)準(zhǔn)臨床樣本的均值0標(biāo)準(zhǔn)-5AB CDE-10050100150200250300Mean Concentration ( x+y) / 2評估各種組合0.70.60.50.40.30.20.10.0-0.1-0.20.70.60.50.40.30.20.10.0-0.1-0.2RM1RM2 RM310RM41000.70.60.50.40.31Mean Concentration (x+0.70.60.50.40.30.20.10.0-0.1-0.2RM1RM2 RM310RM4100R0.20.11Mean Concentration (x+z)/0.0-0.1-0.2RM1RM2 RM310RM4100R0.70.60.50.40.30.20.10.0-0.1-0.21Mean