反相高效液相色譜法測(cè)定薄芝菌絲體中 3種核苷類成分的含量

1、反相高效液相色譜法測(cè)定薄芝菌絲體中 3種核苷類成分的含量【摘要】目的建立高效液相色譜HPL梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定薄芝菌絲體中3種核苷類成分尿嘧啶、尿苷、腺苷的含量。方法采用RP-HPL法測(cè)定，Alltia18柱(5，4.6250)為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫015in，乙腈-水比例為5995，1530in，比例為15985，流速1.0lin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)262n。結(jié)果3個(gè)核苷的線性范圍分別為，尿嘧啶：0.14020.7008g,(r=0.9998,n=5)；尿苷：0.10320.5156g(r=0.9997,n=5)；腺苷：0.12450.6224g(r=0.9994,n=5)。平均加樣回

2、收率分別為：尿嘧啶99.44%，尿苷100.08%，腺苷99.96%。結(jié)論該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、效率高,為全面評(píng)價(jià)薄芝菌絲體質(zhì)量提供一個(gè)可靠方法。【關(guān)鍵詞】反相高效液相色譜法；薄芝菌絲體；梯度洗脫；核苷類成分Abstrat：bjetiveTdeterinethententsfnulesidesinBZhiyeliu(urail,uridine,adensine)byHPLithgradientelutin.ethdsUrail,uridine,adensineeredealtithbyHPLithAlltia-18analytiallun(5,2504.6).Thebilepla

3、sensistedfaetnitrile-ater,gradientelutin(015in,H3N-ater5:995,1530in,H3N-ater15:985).Theflrateas1.0lin-1.TheUVdetetinassetat260n.ResultsThelinearrangesfurail,uridineandadensineere0.14020.7008g(r=0.9998,n=5);0.10320.5156g(r=0.9997,n=5);0.12450.6224g(r=0.9994,n=5)respetively.Theaveragereveryas99.44%;10

4、0.08%and99.96%respetively.nlusinThisethdissiple,reliable,effiient,andprvidesareferenestandardfrthequalityntrlfBZhiyeliu.Keyrds：RH-HPL;BZhiyeliu;Nulesides;Gradientelutin薄芝菌絲體為多孔菌科靈芝屬薄蓋靈芝Ganderaapense(Llyd.)Tend.菌經(jīng)深層培養(yǎng)所得的菌絲體。市場(chǎng)上有用薄蓋靈芝菌絲體為原料制成的薄芝片和注射液，臨床上主要用于硬皮并皮肌炎、多發(fā)性肌炎、紅斑狼瘡、斑禿、銀屑并進(jìn)展性肌營(yíng)養(yǎng)不良、婦女更年期綜合征、神經(jīng)

5、衰弱等病癥治療。對(duì)所含有效成分的含量測(cè)定研究，文獻(xiàn)報(bào)道雖有尿苷作為原料菌絲體含量測(cè)定報(bào)道1，但未見多種成分的測(cè)定報(bào)道，鑒于中藥多組份多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用HPL法對(duì)其原料菌絲體所含成效成分腺苷、尿嘧啶、尿苷3種成分在同一條件下進(jìn)展了含量測(cè)定研究。1儀器與試藥1.1儀器高效液相色譜儀美國(guó)SSISeries泵，檢測(cè)器美國(guó)SSIdel500；Alltia18柱(5,4.6250)；千譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。1.2試藥腺苷對(duì)照品美國(guó)Siga公司，含量99%，批號(hào)1093813；尿嘧啶對(duì)照品美國(guó)Siga公司，含量99%，批號(hào)1083813；尿苷對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)887-200

6、001；溶劑均為分析純和色譜純，超純水。1.3藥材薄芝菌絲體由南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定。2方法與結(jié)果2.1溶液的制備2.1.1對(duì)照品溶液的制備精細(xì)稱取80枯燥至恒重的對(duì)照品：尿嘧啶4.38g，尿苷3.23g，腺苷3.89g，稱定，分別置25l量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度。汲取各對(duì)照品儲(chǔ)藏液1，2，3，4，5l于25l量瓶中，混合，加水稀釋至刻度，搖勻，依次作為1，2，3，4和5號(hào)混合對(duì)照品溶液。2.1.2供試品溶液的制備取本品細(xì)粉1g，精細(xì)稱定，精細(xì)參加水50l，稱定重量，超聲處理1h，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精細(xì)量取續(xù)濾液25l，蒸干，殘?jiān)?/p>

7、2l水溶解，拌入硅膠0.5g，置硅膠小柱100200目，10g內(nèi)徑1.52.0，濕法裝柱上，用丙酮-乙醇31100l洗脫，搜集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀ㄈ葜?5l，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液用0.45微孔濾膜過(guò)濾，即得。2.1.3專屬性實(shí)驗(yàn)用流動(dòng)相及空白溶劑進(jìn)樣,結(jié)果說(shuō)明系統(tǒng)無(wú)污染，陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾。用供試品溶液及混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，單一成分的色譜峰保存時(shí)間與供試品對(duì)應(yīng)成分的色譜峰保存時(shí)間相比擬彼此吻合，說(shuō)明方法專屬性良好。見圖1。理論塔板數(shù)按尿苷峰計(jì)算不低于4000。2.2色譜條件色譜柱為Alltia18柱(5，4.6250)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫0-15in,乙腈-水比例為5995，

8、1540in，比例為15:985;流速為1.0l/in;檢測(cè)波長(zhǎng)262n；柱溫25；進(jìn)樣量20l定量環(huán)。在上述色譜條件下，對(duì)照品、樣品和陰性對(duì)照樣品的色譜圖見圖1。a-對(duì)照品b-樣品-陰性對(duì)照品1.尿嘧啶2.尿苷3.腺苷?qǐng)D1薄芝菌絲體HPL色譜圖2.3線性關(guān)系的考察依次精細(xì)汲取上述15號(hào)混合對(duì)照品溶液各20l進(jìn)樣，按色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量g為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，尿嘧啶、尿苷、腺苷的線性回歸方程分別為：Y=2550596.46X+4005r=0.9998Y=5574605.07X+6115.78r=0.9997Y=9915070.28X-346289.7r=0.99

9、94線性范圍分別為0.14020.7008g，0.10320.5156g，0.12450.6224g。2.4精細(xì)度實(shí)驗(yàn)精細(xì)汲取線性關(guān)系項(xiàng)下3號(hào)混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果平均峰面積分別為：尿嘧啶1063910，RSD為1.10%；尿苷1720815，RSD為1.75%；腺苷1701831，RSD為1.46%。2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品0608136份，分別照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法操作，結(jié)果平均每克含尿嘧啶為0.90g，RSD為1.30%；尿苷為1.11g，RSD為1.06%；腺苷為1.32g，RSD為1.12%。2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取含量測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液(樣品批號(hào)060813),在0，4

10、，8，12，24h汲取上述溶液20l注入液相色譜儀，進(jìn)展穩(wěn)定性考察，結(jié)果平均峰面積分別為尿嘧啶：4410176，RSD為1.58%；尿苷：2449726，RSD為2.58%；腺苷：4855075，RSD為1.82%。2.7加樣回收率分別取含量樣品批號(hào)0608136份，按“2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法,取細(xì)粉約0.5g,精細(xì)稱定,分別精細(xì)定量參加對(duì)照品，制成加樣供試品溶液;按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.8樣品含量測(cè)定取3批樣品,分別按“2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液制備方法,制成供試品溶液；按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表2。表23批樣品的含量測(cè)定結(jié)果3討論3.1流動(dòng)相選擇同時(shí)測(cè)定3種成分，單一體系的流動(dòng)相很難將3種成分在短時(shí)間同時(shí)分開，本實(shí)驗(yàn)采用的梯度洗脫系統(tǒng)使3種成分得到滿意別離。3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇尿嘧啶、尿苷、腺苷在本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相中的紫外光譜262n處，均有較強(qiáng)吸收，應(yīng)選擇262n為檢測(cè)波長(zhǎng)2。3.3提取方法本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇和水提取核苷類成分研究，結(jié)果說(shuō)明水提取效率高于甲醇，故采用水提??；水提取后液相圖譜顯示，5in前有雜質(zhì)峰堆積，采用小柱洗脫，小注洗脫后，液相圖譜顯示