三氧化二砷與刺五加合用誘導HeLa細胞凋亡的實驗研究

1、三氧化二砷與刺五加合用誘導HeLa細胞凋亡的實驗研究【關鍵詞】三氧化二砷；,刺五加；,HeLa細胞；,凋亡摘要：目的討論三氧化二砷與刺五加合用對癌細胞生長的抑制作用及其機理。方法以HeLa細胞的生長抑制情況，流式細胞儀PI單染法檢測藥物誘導細胞的凋亡狀況。結果兩藥合用24h組細胞變小變圓，脫落情況都較其他組明顯，該組細胞生長抑制率明顯高于單用組，合用24h組細胞的凋亡率明顯高于合用16h和8h組P0.01。結論刺五加可以作為三氧化二砷的抗癌增效劑，兩藥合用有很強的抗癌活性，其作用機理與抑制癌細胞生長、誘導其凋亡有關。關鍵詞：三氧化二砷；刺五加；HeLa細胞；凋亡ExperientalStudy

2、ntheApptsisfHeLaellsInduedbyArseniTrixideandaanthpanaxsentisusAbstrat:bjetiveTinvestigatetheanti-tureffetfArsenitrixideandAanthpanaxSentisusnarinaellsanditsprbableehanis.ethdsHeLaellsereulturedasapathlgialdel.HeLaellsstruturalhangeereexainedbyinvertedphaseirspe.Theinhibitineffetnthegrthfellsasevalua

3、tedbyirulturetetrazliuassay(TT).Theapptsisfellseredetetedbyflytetry(F).ResultsTheellsfthegrupftediinesusedtgetherturnedsallerandrunderthanthergrups.Thegrthinhibitedratefthisgrupashigherthanthatfntrlgrup.Theapptsisrateftediinesusedtgether24hursashigherthan16hursand8hurs(P0.01).nlusinAanthpanaxSentisu

4、saniprvetheantitureffetsfArsenitrixide,buthetheritandereasethetxiitiesfArsenitrixiderntisrthrestudying.Keyrds:Aanthpanaxsentisus;Arsenitrixide;HeLaell;Apptsis三氧化二砷As23是中藥砒霜的主要成分，祖國醫(yī)學中它曾被用于治療惡性腫瘤等多種疾病，但As23又是一種能引起機體細胞染色體畸變的劇毒物質(zhì)，故長期以來它的藥用價值一直被其毒副作用所掩蓋，直到近年來，我國研究者發(fā)現(xiàn)As23對急性早幼粒細胞白血病具有良好的治療效果1，2，它的藥用價值才被人

5、們重新審視，有關As23抗腫瘤作用及其機理的研究近年來獲得了較大進展，發(fā)現(xiàn)該藥具有抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡的作用35。刺五加Aanthpanaxsentisus是臨床上常用中藥，具有益氣健脾、補腎安神的成效，可作為細胞毒抗癌藥的輔助劑。動物實驗證實，刺五加能誘導腫瘤細胞凋亡，抑制實驗性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移6。本研究以人宮頸癌細胞系HeLa細胞為病理模型，將刺五加與As23結合作用于HeLa細胞，以討論兩藥合用對腫瘤細胞生長抑制和誘導其發(fā)生凋亡的作用，理解刺五加對As23的抗腫瘤作用是否具有增強效應，為臨床上兩種中藥合用治療惡性腫瘤提供細胞學的實驗根據(jù)。1材料與方法1.1藥品與儀器刺

6、五加注射液20l/支，黑龍江省珍寶島制藥；亞砷酸注射液規(guī)格10g/10l,哈爾濱伊達藥業(yè)；四甲基偶氮唑鹽TT,Ares公司；RPI1640培養(yǎng)基美國GIB公司；新生牛血清杭州四季青生物制品公司；酶標儀560型，美國BIRAD公司，流式細胞儀FASalibur型，美國BD公司；數(shù)碼相機日本ann公司。1.2細胞系HeLa細胞，為人宮頸癌細胞系，購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心T。1.3藥用濃度確實定1.3.1刺五加藥用濃度確實定采用TT法，取對數(shù)生長期HeLa細胞，1105/l的細胞100l至96孔培養(yǎng)板，參加等量不同濃度的刺加五溶液，使各組終濃度分別為0.1，0.5，1，1.5g/l，每個濃

7、度組和對照組均設5個重復孔，以加細胞而不加藥物組為空白對照組。37，5%2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)板，棄舊培養(yǎng)液，每孔參加5g/l的TT溶液20l，37繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔參加DS150l，振蕩15in，使結晶物充分溶解，最后在酶標儀上用490n波長測定各孔的D值，計算細胞存活率和半數(shù)抑制濃度I50，從而確定刺五加的用藥濃度為0.5g/l。1.3.2As23藥用濃度確實定參考文獻，采用最小有效濃度2l/L7。1.4兩藥合用對HeLa細胞的生長抑制實驗采用TT法，實驗共分4組，空白對照組，As23組，刺五加組及As23與刺五加合用組，所有操作方法同3.1，最后計算細胞的生長抑制率。生

8、長抑制率=1-實驗孔平均D值對照孔平均D值100%1.5細胞凋亡的檢測采用流式細胞儀PI單染色法取24孔培養(yǎng)板3個，每板隨機分為4組空白對照組，As23組，刺五加組及As23與刺五加合用組，每組6個重復孔，每孔參加濃度為1105/l的HeLa細胞懸液800l，生長至對數(shù)生長期，去舊液，每孔加含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液，同時分別參加生理鹽水、刺加五溶液，As23及兩藥合加，使每孔液體總量相等，同時保證每孔刺五加終濃度為0.5g/l，As23終濃度為2l/L37，5%2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)8，16，24h后，搜集每組細胞，PBS洗滌1次，離心去PBS，參加冰預冷的70%乙醇3l，4固定24h以上

9、，離心去固定液，3lPBS重懸細胞。離心5in去PBS，每管參加1lPI染液，室溫避光反響30in。制備好的細胞懸液經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾后立即在流式細胞儀上檢測，ELLQuest軟件獲取并分析檢測數(shù)據(jù)。1.6細胞形態(tài)學觀察按上述方法分別讓藥物作用細胞8，16，24h，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并用數(shù)碼相機照相記錄結果。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結果2.1細胞生長抑制率刺五加與As23合用對HeLa細胞增殖有顯著的抑制作用。結果見表1。表1藥物對HeLa細胞的生長抑制率(略)與b比擬，P0.01，與a比擬，P0.012.2HeLa細胞的凋亡分別觀察藥物作用HeLa細胞8，16，24h的

10、凋亡情況，結果顯示兩藥合用能明顯誘導HeLa細胞凋亡，且有明顯的時間依賴性見表2，合用16，24h流式檢測出現(xiàn)明顯的凋亡峰。見圖1。a對照組流式b兩藥合用24h凋亡兩藥合用16h凋亡圖1刺五加與As23合用誘導HeLaxl細胞凋亡的流式檢測圖(略)表2藥物作用HeLa細胞不同時間的細胞凋亡率(略)與相對應時間a，b各組認及生理鹽水組比擬，P0.01；24與8，16比擬P0.01；b與相對時間a組和生鹽鹽組比擬，P0.053討論細胞凋亡apptsis是機體中普遍存在的重要的生物學事件，是受基因調(diào)控的主動性死亡過程，其形態(tài)變化和生化特征明顯不同于細胞壞死，這種特殊的細胞死亡方式對機體發(fā)育和正常功能

11、的維持有重要意義，而腫瘤的發(fā)生開展不僅與腫瘤細胞增殖異常有關，也與腫瘤細胞凋亡異常有親密關系。大量的研究說明，抗腫瘤藥物的一個重要作用機理是誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡2。因此，誘導腫瘤細胞凋亡已成為抗癌藥物設計和挑選的新靶點，與誘導細胞壞死相比，通過誘導細胞凋亡殺死癌細胞不會引起機體強烈的炎癥反響。由于正常細胞與腫瘤細胞在表達某些凋亡相關基因方面存在差異，誘導腫瘤細胞凋亡的治療形式可減少抗癌物損傷正常組織所引起的副作用。自1996-08Siene雜志介紹中國科學家應用As23成功治愈急性早幼粒細胞白血病autepryelytileukeia,APL的成果以來8，對As23抗腫瘤作用的探究引起了世界醫(yī)

12、學界的重視。除白血病以外，As23對實體瘤也有抑制作用，它能誘導多種癌細胞發(fā)生凋亡，其抗癌譜較為廣泛，是一種具有良好應用前景的抗癌藥，該藥誘導細胞凋亡的主要標志為細胞形態(tài)學和生化學等方面的特異性改變7，9。刺五加注射液系刺五加全株經(jīng)提煉而來，含黃酮、刺五加多糖、丁香甙等多種有效成分。該藥所具有扶正固本、益氣健脾、補腎之成效是通過增強機體的免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤效應的10。有研究說明，刺五加多糖對實驗性動物移植瘤，藥物誘發(fā)瘤，小鼠自發(fā)白血病等都有一定的抑制作用，還能減輕某些抗癌藥物的毒性，其作用機理可能與引起細胞膜磷脂的變化有關11，12。HeLa細胞為人宮頸鱗癌上皮細胞系，在體

13、外培養(yǎng)條件下，易于生長繁殖，常被應用于細胞生物學研究和抗癌藥物的挑選，故本實驗選用該細胞系作為病理模型。本研究結果顯示，刺五加與As23合用對HeLa細胞具有明顯的生長抑制和誘導凋亡作用，合用組細胞的生長抑制率和凋亡率分別與兩藥的單用組比均具有顯著性差異P0.01。說明刺五加與As23合用具有很強的抗腫瘤活性兩者可產(chǎn)生協(xié)同作用，刺五加可以作為As23抗腫瘤作用的增效劑。至于兩藥合用抗腫瘤作用的分子機理還有待進一步研究。參考文獻：1張鵬.王樹葉，胡龍虎，等.三氧化二砷注射液治療72例急性早幼粒白血病J.中華血液學雜志，1996，172：58.2ShenZX,henGQ,NiJH,etal.Use

14、farsenitrixideinthetreatentfautepryelyti:linialeffiayandpharakinetisinrelapsedpatientsJ.Bld,1997,89(9):3354.3KarenH.A.Intrdutin:ThehistryfArsenitrixideinanertherapyJ.Thenlgist,2001,6(2):1.4haadA.H.D.TrialsfArseniTrixideinultipeylaJ.anerntrl,2022,10(5):370.5黃瀏姣，趙剛.三氧化二砷抗腫瘤作用及其機理的研究現(xiàn)狀和展望J.湖北中醫(yī)學院學報，202

15、2，71：60.6馮雪梅，葉紅軍，韓登春，等.刺五加葉皂甙對動物實驗性肝癌抑制作用的研究J.中國老年醫(yī)學雜志，1999，195：298.7呂秀寧，鄭杰.As23誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡與細胞內(nèi)端粒酶活性關系的研究J.東南大學學報醫(yī)學版2022，224：227.8GurrJR,LinY,HKy,etal.IndutinfhratidbreaksandtetrapldyinhinesehastervaryellsbytreatentithsdiuarseniteduringG2phaseJ.utatRes,1993,319(2):135.9YuDing,angZhihui,ZhuLiyuan,etal.NulearatrixassiatedprtEinPL:anarsenitrixideapptsistherapeutitargetprtEIninHepG2ellsJ.hineseedi