強(qiáng)力霉素對(duì)移植肺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的研究

1、強(qiáng)力霉素對(duì)移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的研究【摘要】目的討論外源性基質(zhì)金屬蛋白酶(atrixetallprtEinases，Ps)抑制劑強(qiáng)力霉素在移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響。方法建立大鼠自體左肺肺缺血再灌注模型，16只SD受體大鼠隨機(jī)分為兩組:缺血再灌注組和強(qiáng)力霉素組，用免疫組化方法觀察移植肺Bl-2、Bax和aspase-3表達(dá)情況，并取肺組織平滑肌細(xì)胞進(jìn)展培養(yǎng)，采用熒光技術(shù)測(cè)定肺組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果肺缺血再灌注后，與對(duì)照組相比，強(qiáng)力霉素組移植肺Bax和aspase-3表達(dá)明顯降低(P0.01)，Bl-2的表達(dá)無明顯變化(P0.05)，但Bl-2/Bax比例升高；熒光圖片顯示，

2、強(qiáng)力霉素組的細(xì)胞凋亡明顯較對(duì)照組減少。結(jié)論強(qiáng)力霉素可能通過下調(diào)Bax、aspase-3表達(dá)，進(jìn)步Bl-2/Bax比例而抑制肺缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡，并通過降低基底膜的降解，減輕肺水腫，到達(dá)bliterativebrnhitis，B發(fā)生率相關(guān)。因此，研究低溫肺保存后再灌注損傷的機(jī)制，改善移植肺功能，仍然是肺移植領(lǐng)域中所急需解決的重點(diǎn)課題之一。眾多研究說明，體重250340g，隨機(jī)分為兩組：A組n=8：缺血IR組，大鼠左肺經(jīng)歷原位熱缺血30in、冷缺血3h、熱缺血30in和不同時(shí)間的再灌注處理；B組n=80.5g/kg，30g/L的戊巴比妥鈉30g/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后，將大鼠右側(cè)斜位固定

3、于手術(shù)臺(tái)上。氣管切開插管連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)。輔助呼吸參數(shù)為：潮氣量10l/kg，呼吸頻率75次/in，吸入氧濃度Fi21.0，呼氣末正壓2.0H2。右側(cè)頸動(dòng)脈插管，用于采集標(biāo)本、監(jiān)測(cè)血壓；右側(cè)頸靜脈穿刺備用；尾靜脈微量注射泵持續(xù)補(bǔ)液，速度為4.0l/(kgh)。經(jīng)左第5肋間前外側(cè)切口進(jìn)胸并橫斷胸骨，翻開縱隔。頸靜脈注射肝素鈉375.U/kg后，剝離左肺門，離斷左下肺韌帶；經(jīng)左向右游離右肺動(dòng)脈、靜脈及主支氣管，預(yù)置阻斷帶。然后用一塑料袋內(nèi)徑約2.5套住左全肺，并在肺門處形成反折，連同塑料袋一起用無創(chuàng)傷鉗于吸氣末阻斷左肺門根部1，2，此時(shí)潮氣量減至8.0l/kg，呼吸頻率100次/in，其他參數(shù)不

4、變。30in后，在反折的塑料袋參加冷生理鹽水及小冰塊，把套有塑料袋的左肺上提至切口平面勿與周圍臟器接觸。袋內(nèi)置一溫度計(jì)使之保持在4左右。冷缺血3h后去除冷鹽水，使左肺又轉(zhuǎn)變?yōu)闊崛毖?30in后松開無創(chuàng)傷鉗，形成再灌注。同時(shí)頸靜脈給予魚精蛋白2.43.0g/kg。待血壓、呼吸穩(wěn)定后肉眼上，左肺變得紅潤(rùn)，約需10inPVEs的培養(yǎng)與鑒定結(jié)合應(yīng)用鹽酸氯氨酮(20g/kg)和安定(2g/kg)麻醉，開胸在左心室剪一小口，從右心室注入20lD-Hanks液(在1L去離子水中參加參加12滴胎牛血清，接種到T25的培養(yǎng)瓶中，372孵箱中放置30in，參加或參考空間，將上述檢測(cè)分子的陽性面積除以包容空間，取其

5、均值%作為“陽性區(qū)域面積參加20l的0.5g/lHehst33258儲(chǔ)存液，室溫放置10in，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞并拍片。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，兩組間比擬采用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Bl-2、Bax、aspase-3蛋白程度變化與對(duì)照組相比，強(qiáng)力霉素組Bax和aspase-3表達(dá)明顯降低(P0.01)，Bl-2表達(dá)無明顯增高(P0.05)表1。表1各組Bl-2、Bax和aspase-3的表達(dá)%(xs，n=8)那么整齊，染色質(zhì)均勻分布(圖1)，對(duì)照組的PVEs細(xì)胞核那么出現(xiàn)不均勻亮度的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核

6、先后呈現(xiàn)凋亡早期(波紋狀)、中期(核染色質(zhì)凝聚，邊緣化)和晚期(核裂解，產(chǎn)生凋亡小體)的典型變化，其凋亡的細(xì)胞主要是肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)。3討論缺血再灌注損傷是肺移植后早期出現(xiàn)原發(fā)性移植物功能不全priarygraftfailure，PGF的主要原因，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)展性的低氧血癥，肺順應(yīng)性降低，毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致肺水腫，在X線胸片上表現(xiàn)為廣泛的肺泡密度增高影2。此外，IR可引發(fā)早期的排擠反響，并與移植后晚期較高的閉塞性支氣管炎B發(fā)生率相關(guān)4。因此開展移植肺IR損傷的研究對(duì)肺移植的成敗顯得尤為重要。凋亡是以DNA發(fā)生特異性的片段化斷裂，形態(tài)上表現(xiàn)為核固縮、胞膜內(nèi)陷、皺縮、包裹胞質(zhì)

7、形成凋亡小體為特征，受特定的基因調(diào)控。Fisher及Staberger等都曾提出凋亡為肺缺血再灌注損傷的早期事件5，6。雖然肺缺血再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞因子等是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素，但這些因素并不直接引起細(xì)胞凋亡，而是通過一定的信號(hào)傳遞方式激活生存與死亡的相關(guān)基因(如Bl-2、Bax、p53等)，然后將信號(hào)傳遞到核內(nèi)切酶，激活aspase-3執(zhí)行死亡功能。其中Bl-2和Bax是兩個(gè)重要的相關(guān)基因，前者抑制細(xì)胞凋亡，而后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且Bl-2和Bax蛋白表達(dá)的比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵7。本實(shí)驗(yàn)也證明，再灌注后肺組織細(xì)胞凋亡明顯增加，參與肺損傷作用。強(qiáng)力霉素能抑制在體肺缺血再灌

8、注損傷中血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax和aspase-3表達(dá)，對(duì)Bl-2的表達(dá)無明顯影響，但Bl-2/Bax的比例明顯進(jìn)步，從而發(fā)揮抗肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。缺血-再灌注的損傷機(jī)制雖很復(fù)雜，但微血管完好性被破壞是其損傷的中心環(huán)節(jié)8。血管基底膜是控制微血管通透性的最重要的構(gòu)造。外源性基質(zhì)金屬蛋白酶atrixetallprtEinases，Ps是一類以Zn2+為輔助因子的蛋白酶家族，其中P-2和P-9能降解肺毛細(xì)血管基底膜的基質(zhì)成分，與微血管完好性親密相關(guān)9。生理?xiàng)l件下，大鼠肺組織能表達(dá)低程度的prP-2及活性P-2、prP-9，幾乎不表達(dá)活性P-910。缺血、缺氧條件下可以誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等分泌Ps；同時(shí)缺血-再灌注誘發(fā)炎癥反響，此時(shí)，炎性細(xì)胞成為Ps的重要來源。強(qiáng)力霉素是四環(huán)素類抗生素的一種，大量研究顯示四環(huán)素類及它們經(jīng)化學(xué)改進(jìn)、非抗生素類似物是一類廣譜的P抑制劑。其參與肺缺血再灌注損傷的可能機(jī)制表如今以下幾個(gè)方面11：(1)抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；(2)通過去除其他細(xì)胞產(chǎn)生的反響性氯化物阻止P酶原的激活；(3)抑制其他