囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的優(yōu)勢及操作解析

1、囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的優(yōu)勢及操作解析【引用本文】高英卓，楊大磊，馮迪，等.囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的優(yōu)勢及操 作解析J.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2020,36（9）:884-887.作者：高英卓，楊大磊，馮迪，王秀霞，李達(dá)1990年Handyside團(tuán)隊首次對攜帶不同X-連鎖隱性遺傳病基因的兩對夫婦的 胚胎進(jìn)行了檢測，篩選合適的胚胎性別并種植后順利妊娠。如今植入前遺傳學(xué)檢 測（PGT）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于全世界的生殖中心并得到了迅速的發(fā)展。PGT技術(shù) 是指在體外受精-胚胎移植技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對配子或胚胎進(jìn)行活檢，獲取部 分遺傳學(xué)物質(zhì)進(jìn)行染色體和（或）基因?qū)W檢測，診斷其是否存在單基因缺陷、非 整倍

2、體或染色體拷貝數(shù)異常等，選擇正常胚胎植入子宮，從而獲得健康的子代。 PGT技術(shù)的成功實施需要依賴可靠的活檢技術(shù)獲取可用于檢測的胚胎遺傳物質(zhì)， 而活檢的過程對胚胎而言是一項侵入性的操作，活檢是否成功將直接影響到PGT 的最終結(jié)局。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，雖然部分檢測已經(jīng)可以使用無創(chuàng) 或微創(chuàng)的方式進(jìn)行遺傳物質(zhì)的獲取，但其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性尚存爭議。因此，目 前仍以有創(chuàng)方式獲取遺傳物質(zhì)為主，即活檢技術(shù)。PGT活檢技術(shù)根據(jù)活檢時間 可分為極體活檢、卵裂球活檢與囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢:極體活檢是在取卵當(dāng)天或 受精后第1天）獲取極體用于遺傳學(xué)檢測，可以檢測母源性的染色體非整倍體和 易位，但無法檢測父源性遺

3、傳缺陷；卵裂球活檢則是在受精后第3天（68個 細(xì)胞階段），獲取12個細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測；囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是在受精后第5天或第6天，胚胎發(fā)育至囊胚階段時，獲取510個滋養(yǎng)層細(xì)胞用于遺 傳學(xué)檢測。1囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的優(yōu)勢1.1胚胎損傷小卵裂球活檢是從68個細(xì)胞中抽取12個細(xì)胞用于遺傳學(xué)檢 測，而囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢則是在數(shù)百個細(xì)胞中抽取510個滋養(yǎng)層細(xì)胞用于檢 測。已有證據(jù)表明，卵裂球活檢可能會損害胚胎的發(fā)育潛能及種植能力。此外， 卵裂球活檢時，為了使卵裂球之間連接變得松散，需要利用無Ca2+/Mg2+的 緩沖液處理胚胎，利用時差顯微培養(yǎng)系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)這一操作會延遲胚胎致密化和 成囊過程，并降

4、低種植率。滋養(yǎng)層細(xì)胞將來會發(fā)育成胎盤或胎膜，不直接參與胎 兒形成。因此，滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢可有效避免損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而減小活檢操作對 胚胎發(fā)育的影響。1.2診斷準(zhǔn)確性高囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢用于遺傳學(xué)檢測的細(xì)胞數(shù)量（5 10個）遠(yuǎn)多于卵裂球活檢（12個），提高了診斷準(zhǔn)確性，降低了擴(kuò)增失敗的風(fēng)險。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)自身的顯著優(yōu)勢以及極體活檢和卵裂球活檢技術(shù)自身 的局限性，結(jié)合近些年囊胚培養(yǎng)和囊胚冷凍技術(shù)的逐漸成熟，滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技 術(shù)已成為目前應(yīng)用最為廣泛的活檢技術(shù)。2囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的操作解析根據(jù)活檢策略不同，囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)可分為第3天胚胎孵化后活檢方 案、桑葚胚孵化后活檢方案、囊胚

5、當(dāng)天孵化后活檢方案和囊胚即時孵化后活檢方 案（圖1）。第4天肝胎孵化后活榆方案I桑甚胚孵化后活檢方案版胚大孵化后活檢方案參若6期癱胚 插檢方案甘天。小時第供4天囊胚即時孵化后活檢方案圖1囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢策略胎孵化后活檢方案（圖1A）。胚胎培養(yǎng)至受精后第3天進(jìn)行輔助孵化，使透明 帶形成開口，用來減弱透明帶對胚胎的束縛作用，使胚胎更易于孵出。透明帶開 口位置應(yīng)位于透明帶與卵裂球之間存在間隙處或碎片處，避免損傷卵裂球。隨后 將胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第5天或第6天，待部分滋養(yǎng)層細(xì)胞孵出后進(jìn)行活檢。透明帶開口主要有3種方法：化學(xué)法、機(jī)械法和激光法?；瘜W(xué)法是利用酸性臺式 液（pH值2.22.6 ）溶解透明帶。將

6、裝滿酸性臺式液的顯微操作針對準(zhǔn)透明帶， 通過噴灑臺式液溶解透明帶，使透明帶形成開口。操作動作應(yīng)熟練迅速，當(dāng)透明 帶形成開口后，立即停止噴灑臺式液，避免損傷卵裂球。機(jī)械法透明帶開口是利 用尖頭的顯微操作針刺破透明帶。胚胎在持卵針固定下，操控顯微操作針沿著透 明帶切線方向刺破并穿過透明帶，隨后松開持卵針，借助持卵針和顯微操作針之 間的摩擦使透明帶開口。機(jī)械法操作快捷，然而其開口的大小具有不確定性。激 光法是利用非接觸式紅外線（1.48pm ）二極管產(chǎn)生的激光，將其對準(zhǔn)并擊打目 標(biāo)區(qū)域，使透明帶形成開口。激光開口的大小和位置可以實現(xiàn)精確控制，且具有 較強(qiáng)的可操作性和重復(fù)性，是目前最常用的透明帶開口方

7、法。第3天胚胎孵化后活檢方案實施起來相對容易，易于掌握，然而其也存在諸多弊 端，例如：在受精后第3天實施輔助孵化后，由于透明帶存在開口，破壞了囊胚 腔擴(kuò)張、透明帶變薄這一正常發(fā)育過程，其對囊胚發(fā)育潛能的影響存在爭議，有 證據(jù)表明，卵裂期激光開口有可能降低胚胎發(fā)育潛能，改變胚胎表觀遺傳修飾； 囊胚的孵出位置具有不確定性，如果內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出，為避免活檢損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)， 只能等到囊胚完全孵出再進(jìn)行活檢操作；在等待囊胚孵出過程中，需要反復(fù)觀察胚胎狀態(tài)，增加了對胚胎發(fā)育的干擾;如果第3天打孔的卵裂期胚胎未形成囊胚， 那么之前的輔助孵化操作便成為徒勞。2.2桑葚胚孵化后活檢方案桑葚胚孵化后活檢方案是指在受精后

8、第4天，以透 明帶開口的方式對桑葚胚進(jìn)行輔助孵化，隨后胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第5天或第6天， 待囊胚孵出后，對孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢（圖1A）。與第3天胚胎孵化后 活檢方案相比，其優(yōu)勢在于胚胎發(fā)生致密化之后，其形成囊胚的概率大大增加， 可以明顯減少活檢人員實施輔助孵化的胚胎數(shù)量。如果胚胎發(fā)育速度較快，在取 卵后第4天即可發(fā)育至早囊階段，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置隱約可見，輔助孵化時可以避 開內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。然而，大多數(shù)情況下，此方法可能面臨內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出的風(fēng)險，且仍 需在培養(yǎng)過程中多次觀察胚胎的發(fā)育狀態(tài)。2.3囊胚當(dāng)天孵化后活檢方案囊胚當(dāng)天孵化后活檢方案是在受精后第5天或第 6天早晨，對囊胚進(jìn)行輔助孵化（透明帶開口），

9、隨后將囊胚放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培 養(yǎng)，期間需要反復(fù)觀察囊胚發(fā)育狀態(tài)，直到囊胚孵出再進(jìn)行活檢（圖1A）。此 方案優(yōu)點(diǎn)在于：策略相對簡單，對活檢人員要求較低。然而，由于輔助孵化后， 囊胚孵出所需時間不確定，活檢人員需要反復(fù)觀察囊胚狀態(tài)，大大增加工作量， 尤其是對于工作量較大的胚胎實驗室，顯著降低了工作效率。另外，由于各個囊 胚的孵出速度不同，活檢人員可能需要分批次進(jìn)行活檢。然而，與第3天/桑葚 胚孵化后活檢方案相比，第5天或第6天的囊胚可以明確判斷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置， 實現(xiàn)有效控制輔助孵化的位置，避開內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。6天，對完全擴(kuò)張期囊胚進(jìn)行透明帶打孔，使透明帶形成一個狹窄的孔道，隨后 立即用活檢針沿透明帶孔道吸

10、取510個滋養(yǎng)層細(xì)胞用于遺傳學(xué)檢測（圖 1BF）。已有證據(jù)表明，囊胚即時孵化后活檢方案可取得更好的臨床結(jié)局，其 囊胚冷凍率、解凍復(fù)蘇率、臨床妊娠率均高于第3天胚胎孵化后活檢方案。與囊 胚當(dāng)天孵化后活檢方案相比，囊胚即時孵化后活檢方案的優(yōu)勢在于無需提前輔助 孵化，當(dāng)囊胚發(fā)育至完全擴(kuò)張的4期之后，可以隨時在透明帶打孔并立即進(jìn)行活 檢，既能簡化工作流程，又能節(jié)約時間。然而，由于囊胚的發(fā)育速度參差不齊， 根據(jù)囊胚的不同特征，需要采取不同的活檢方法，對活檢人員提出了更高的要求。近期，Yang等對不同特征的囊胚活檢方法進(jìn)行了全面、系統(tǒng)地總結(jié)，為囊胚即 時孵化后活檢方案的廣泛應(yīng)用提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。4期囊胚的

11、活檢：首先對囊胚 進(jìn)行人工皺縮，根據(jù)囊胚隨后的皺縮狀態(tài)（塌陷或未塌陷），采用不同的活檢方 法。如果人工皺縮后囊胚明顯塌陷，在滋養(yǎng)層細(xì)胞與透明帶剝離處（遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞 團(tuán)），使用激光進(jìn)行透明帶打孔，利用活檢針經(jīng)孔道吸取510個滋養(yǎng)層細(xì)胞， 隨后將滋養(yǎng)層細(xì)胞切割下來（圖1B）。如果囊胚未塌陷，可借助活檢針經(jīng)孔道 向透明帶內(nèi)注入培養(yǎng)基，促使滋養(yǎng)層細(xì)胞與透明帶剝離，后續(xù)操作與塌陷囊胚相 同。5期囊胚根據(jù)形態(tài)可分為花生形”和“8字形”?！盎ㄉ文遗叩幕顧z方式：首 先在孵出區(qū)域的滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處用激光擊打使其皺縮，待囊胚皺縮回透明帶 后，持卵針控制住胚胎，在持卵針對側(cè)的透明帶進(jìn)行人工打孔，經(jīng)孔道用活檢針 吸取

12、滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖1C）?！?字形囊胚的活檢方法相對簡單，可直接吸取孵出 滋養(yǎng)層細(xì)胞用于活檢，后續(xù)操作參考4期囊胚。如果“8字形囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出，先對位于透明帶內(nèi)部的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行人工皺縮，之后的活檢方法可參考4 期囊胚（圖1D）。6期囊胚的活檢：直接利用持卵針固定囊胚（避免吸住內(nèi)細(xì) 胞團(tuán)），利用活檢針吸取滋養(yǎng)層細(xì)胞。需注意的是，活檢之前轉(zhuǎn)移6期囊胚時， 應(yīng)使用孔徑較大的巴氏德吸管，避免擠壓引起囊胚塌陷（圖1E）。一旦囊胚塌 陷，一方面細(xì)胞皺縮在一起，滋養(yǎng)層細(xì)胞不易被吸進(jìn)活檢針，增加了操作難度； 另一方面，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層細(xì)胞緊緊包裹在一起，使得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置不易辨 別，有可能在活檢過程中誤傷內(nèi)

13、細(xì)胞團(tuán)。另外，對于接近完全孵出的囊胚，即只 有小部分滋養(yǎng)層細(xì)胞殘留在透明帶里，應(yīng)先將囊胚拽出透明帶，隨后的活檢方法 參考6期囊胚（圖1F）。滋養(yǎng)層細(xì)胞的切割方法有激光法和機(jī)械法:激光法是利用激光擊打使滋養(yǎng)層細(xì)胞 離斷。滋養(yǎng)層細(xì)胞被吸進(jìn)活檢針里之后，一邊牽拉滋養(yǎng)層細(xì)胞，一邊用激光擊打 細(xì)胞，約35次激光擊打之后，可離斷滋養(yǎng)層細(xì)胞；機(jī)械法是利用活檢針與持 卵針之間的摩擦離斷滋養(yǎng)層細(xì)胞。滋養(yǎng)層細(xì)胞被吸進(jìn)活檢針后，松開持卵針，將 活檢針移至持卵針的上緣，迅速向下移動活檢針，即可離斷滋養(yǎng)層細(xì)胞。近期， Yang等提出的微激光-鈍性切割方法是將激光法與機(jī)械法有機(jī)結(jié)合，活檢針吸 取滋養(yǎng)層細(xì)胞并向外卜牽拉使其

14、伸長激光擊打位于透明帶外緣的滋養(yǎng)層細(xì)胞12 次，隨后利用機(jī)械法離斷滋養(yǎng)層細(xì)胞，12次的激光擊打有助于后續(xù)機(jī)械法切 割滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖2）。此方法有效減少了激光擊打次數(shù)，減小了激光帶來的熱 損傷。圖2 微激光-鈍性切割方法技術(shù)要點(diǎn)3囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的爭議無論是通過IVF還是自然受孕，胚胎均可能出現(xiàn)嵌合體。嵌合體是指胚胎包含2 種及以上的遺傳學(xué)不同的細(xì)胞系，文獻(xiàn)報道的嵌合體發(fā)生率從30%90%不等。 各個IVF實驗室嵌合體發(fā)生率的差異受多個因素的影響，例如遺傳學(xué)檢測技術(shù)、 非整倍體的界定標(biāo)準(zhǔn)、活檢取材部位的選擇以及實驗室培養(yǎng)環(huán)境等。因此，關(guān)于 囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢可靠性的爭議，主要在于滋養(yǎng)層細(xì)胞的核型是否可以代表內(nèi) 細(xì)胞團(tuán)的核型。諸多研究討論了滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)活檢診斷一致性的問 題，診斷一致率為96.1%100%。就目前的發(fā)展現(xiàn)狀來說，囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活 檢仍是最可靠的遺傳學(xué)檢測方法。另外，囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢技術(shù)的爭議還包括 部分PGT治療周期患者可能由于無囊胚形成而取消周期。但隨著IV