健腎解毒腹膜透析液（Ⅲ）指紋圖譜的建立

1、健腎解毒腹膜透析液指紋圖譜的建立【摘要】目的運(yùn)用中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代色譜分析技術(shù)，研究建立健腎解毒腹膜透析液()HPL-ELSD指紋圖譜分析方法，為平安有效地控制其質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法選擇LihrARTHPL-KartusheRP-18e色譜柱，柱溫25，以流動相A=乙腈，B=水組成的梯度洗脫系統(tǒng)，流速0.8lin，ELSD參數(shù)漂移管溫度106，氮?dú)饬魉?.00l/in。結(jié)果建立了健腎解毒腹膜透析液的指紋圖譜。結(jié)論所建立的健腎解毒腹膜透析液()HPLELSD指紋圖譜分析方法，可有效地控制其質(zhì)量，為研制平安有效的健腎解毒腹膜透析液提供了新的實(shí)驗(yàn)基?！娟P(guān)鍵詞】健腎解毒腹膜透析液(JSPDS()；黃芪

2、；高效液相色譜法；指紋圖譜Keyrds：JianshenjieduPeritnealDialysisSlutin(JSPDS()；Radixastragali；Highperfranliquidhratgraphy；hratgraphifingerprintdiagra健腎解毒腹膜透析液JianshenjieduPeritnealDialysisSlutin，JSPDS()是由黃芪、丹參、大黃等中藥有效部位組成的、用于治療慢性腎功能衰竭的新型中藥復(fù)方制劑。中藥黃芪性溫味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒等功能。中醫(yī)臨床上可用于治療氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，

3、氣虛水腫，慢性腎炎蛋白尿等。黃芪有效部位為JSPDS()君藥，應(yīng)選擇黃芪甲苷作為指標(biāo)成分，本研究根據(jù)現(xiàn)代色譜分析技術(shù)程度，建立JSPDS成品的RPHPLELSD法指紋圖譜分析方法，更加全面地評價(jià)其質(zhì)量1。1儀器與試藥1.1儀器Agilentl100高效液相色譜儀，Alheh2000型蒸發(fā)光散射檢測器，AgilentheSatinfrLandLSsystes色譜工作站；BP一211D型電子分析天平(德國Satritxs公司)。1.2試藥1.2.1健腎解毒腹膜透析液的制備先將黃芪、丹參、大黃3種藥材分別用煎煮、柱層析、有機(jī)溶劑提取等提取別離方法制備成各自的中間體，再將3種藥材中間體按一定比例參加其

4、他藥物制備成健腎解毒腹膜透析液制劑2。1.2.2其他試藥黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0781202211)；乙腈(色譜純，erk公司)；重蒸餾水；其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1色譜條件LihrARTHPL-KartusheRP-18e色譜柱(25046，5)；流動相A-乙腈，B-水，梯度洗脫見表1。流速0.80l/in，進(jìn)樣量20l，柱溫25，ELSD參數(shù)漂移管溫度106，氮?dú)饬魉?.00l/in，理論板數(shù)以黃芪甲苷計(jì)算不低于4000。表1乙腈水梯度洗脫略2.2參照物峰的選擇與參照物溶液的制備因黃芪甲苷為有效部位指標(biāo)性成分，且在HPL指紋圖譜中黃芪甲苷的色譜峰面積較大

5、、穩(wěn)定，應(yīng)選擇黃芪甲苷的色譜峰為參照物峰3，計(jì)算其它色譜峰的相對保存時(shí)間和相對峰面積。精細(xì)稱取黃芪甲苷對照品10.03g,置于10l量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含黃芪甲苷1.003g的參照物溶液。2.3供試品溶液和陰性對照溶液的制備與測定按處方精細(xì)稱取JSPDS()凍干粉適量，加水適量溶解并稀釋，用0.45微孔濾膜過濾，即得供試品溶液(2gL)，同法制得陰性對照溶液。分別汲取供試品溶液、參照物溶液及陰性對照溶液各20l，注入高效液相色譜儀，記錄60in色譜圖，陰性對照溶液的色譜圖無干擾。2.4方法學(xué)考察2.4.1精細(xì)度實(shí)驗(yàn)取JSPDS同一供試品溶液，連續(xù)注入高效液相色譜儀5

6、次，考察各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的RSD均小于3，精細(xì)度良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求4。2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批JSPDS分別制備供試品溶液6份，分別注入高效液相色譜儀，考察各色譜峰相對保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的RSD均小于3，重復(fù)性良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求。2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一JSPDS供試品溶液，分別在0，2，4，8，16h時(shí)，室溫(25)下檢測，考察各色譜峰相對保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，JSPDS()供試品溶液16h內(nèi)，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面

7、積比值的RSD均小于3，穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求。2.510批JSPDS()試品指紋圖譜根據(jù)10批JSPDS試品的檢測結(jié)果，比擬其特征色譜圖(見圖1)，確定各批JSPDS()共有的、相對穩(wěn)定的7個(gè)色譜峰為共有峰，10批試品相對保存時(shí)間見表2。共考察10批JSPDS成品指紋圖譜，選擇7個(gè)色譜峰為共有峰，其保存時(shí)間峰號分別約為1.484in(1)，4.420in2，12.154in3，12.983in4，15.353in5，16.847in6，27.719in7，S。其中，黃芪甲苷為7號峰，為S峰。測試條件下，l0批JSPDS供試品檢測結(jié)果說明：主要共有峰面積比值為234567(S)=0.

8、2100.390.2720.5040.1370.2550.1300.2420.08260.1531.000。共有峰面積占總峰面積比值(見表3)均大于95，非共有峰面積占總峰面積比值均小于5，符合指紋圖譜規(guī)定要求5。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件A版(中國藥典委員會推薦)分析評價(jià)相似度。共測定l0批JSPDS的RPHPLELSD指紋圖譜，相似度均大于0.900，符合指紋圖譜要求(0.9001.000)。表210批JSPDS()指紋圖譜評價(jià)結(jié)果(相對保存時(shí)間)略表310批JSPDS()主要共有峰峰面積比值略3討論黃芪藥材及制劑的指紋圖譜研究已有少量相關(guān)報(bào)道68，然而JSPDS()是一種新制

9、劑，除了黃芪外還包含其他有效成分，以往文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件并不適用于JSPDS()914。本次研究采用的方法適用于JSPDS()，可有效地控制其質(zhì)量，為研制平安有效的JSPDS()提供了新的實(shí)驗(yàn)基矗指紋圖譜相似度的評價(jià)方法有歐氏間隔 法、絕對間隔 法、insky間隔 法、夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法以及峰匹配度法等6種5，1516，相比擬而言，峰匹配法能較靈敏地檢測小峰個(gè)數(shù)波動，歐氏間隔 測定法那么具有較好的綜合評價(jià)才能，夾角余弦法對于檢測指紋圖譜間譜峰比例關(guān)系的變動較為適宜，因此，更適于分析評價(jià)不同批次間藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性。故在建立指紋圖譜分析方法中選擇夾角余弦法評價(jià)JSPDS藥材、中間體和成品的相似

10、度。在建立JSPDS成品的指紋圖譜實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用了梯度洗脫的方法，較好地使每個(gè)色譜峰得到根本別離。因ELSD漂移管溫度和N2流速等參數(shù)不能隨著流動相比例的變化設(shè)定，故應(yīng)用HPL-ELSD法進(jìn)展梯度洗脫，與HPL-DAD法相比有局限性，流動相比例變化不能太大，參數(shù)的設(shè)定一般以梯度洗脫中極性較大的流動相為主要參考。實(shí)驗(yàn)說明，在指紋圖譜研究中，由于中藥成分復(fù)雜，使用等度洗脫系統(tǒng)往往難以得到反映全組分指紋特征的HPL色譜圖。在對JSPDS()指紋圖譜研究中，采用了梯度洗脫方法，使色譜峰得到較好的別離。找到適宜的梯度洗脫系統(tǒng)是JSPDS()指紋圖譜方法建立的關(guān)鍵。致謝：在本課題完成過程中，得到傅曉晴教授、

11、陳鼎雄主任藥師的悉心指導(dǎo)及大力支持，在此表示衷心的感謝！【參考文獻(xiàn)】1任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用J.中藥新藥與臨床藥理，2002，123：135.2陳丹,劉文英,王二麗.健腎解毒腹膜透析液()中總皂苷的含量測定J.中醫(yī)藥學(xué)刊,2022,23(1):79.3林奇泗,陳丹,王二麗.健腎解毒腹膜透析液HPLELSD定量方法的建立J.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,31(4):77.4國家藥品監(jiān)視管理局中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求暫行J.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2000，14：3.5王璽，王文宇，張克榮,等.中藥HPL指紋圖譜相似性研究的討論J.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2022，20(5):360.6胡

12、芳弟,趙健雄,封士蘭，等.黃芪的高效液相色譜指紋圖譜及主成分的含量測定J.中藥材,2022，2711：831.7徐青，王加寧，肖紅斌，等.黃芪藥材的指紋圖譜的研究方法的建立J.分析測試學(xué)報(bào),2002，212：89.8曾令杰，陳矛，王德勤.HPL指紋圖譜的中成藥質(zhì)量控制形式研究J.中成藥,2022，255:347.9林奇泗,陳丹,王二麗.健腎解毒腹膜透析液指紋圖譜的建立J.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,28(5):319.10王雁,畢開順.三七HPL指紋圖譜的建立J.中國中藥雜志,2022,28(4)：316.11高增平,陸蘊(yùn)如,王寶華.三七藥材指紋圖譜研究J.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2022,9(1)

13、：11.12王穎,陳新發(fā),盛龍生.三七注射液指紋圖譜的LS測定J.中藥新藥與臨床藥理,2001,12(3)：160.13夏泉,李紹平,黃趙剛，等.三七總皂苷注射液HPL指紋圖譜的比擬分析J.中成藥,2022,26(5)：345.14高增平,陸蘊(yùn)如,孫偉.血栓通注射液指紋圖譜研究J.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2002,8(6)：1.15孟慶華，劉永鎖，王健松，等.色譜指紋圖譜相似度的新算法及其應(yīng)用J.中成藥,2022,25(1):4.16程冀宇,陳閩軍,吳永江.化學(xué)指紋圖譜的相似性測度及其評價(jià)方法J.化學(xué)學(xué)報(bào),2002,60(11)：2022.轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.【摘要】目的運(yùn)用中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代色譜

14、分析技術(shù)，研究建立健腎解毒腹膜透析液()HPL-ELSD指紋圖譜分析方法，為平安有效地控制其質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法選擇LihrARTHPL-KartusheRP-18e色譜柱，柱溫25，以流動相A=乙腈，B=水組成的梯度洗脫系統(tǒng)，流速0.8lin，ELSD參數(shù)漂移管溫度106，氮?dú)饬魉?.00l/in。結(jié)果建立了健腎解毒腹膜透析液的指紋圖譜。結(jié)論所建立的健腎解毒腹膜透析液()HPLELSD指紋圖譜分析方法，可有效地控制其質(zhì)量，為研制平安有效的健腎解毒腹膜透析液提供了新的實(shí)驗(yàn)基?！娟P(guān)鍵詞】健腎解毒腹膜透析液(JSPDS()；黃芪；高效液相色譜法；指紋圖譜(DepartentfPharalgy，Z

15、hangzhuedialVatinalllege,Zhangzhu363000,hina;DepartentfPharay，F(xiàn)ujianllegefTraditinalhineseediine，F(xiàn)uzhu350003,hina)Keyrds：JianshenjieduPeritnealDialysisSlutin(JSPDS()；Radixastragali；Highperfranliquidhratgraphy；hratgraphifingerprintdiagra健腎解毒腹膜透析液JianshenjieduPeritnealDialysisSlutin，JSPDS()是由黃芪、丹參、大黃等

16、中藥有效部位組成的、用于治療慢性腎功能衰竭的新型中藥復(fù)方制劑。中藥黃芪性溫味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒等功能。中醫(yī)臨床上可用于治療氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，慢性腎炎蛋白尿等。黃芪有效部位為JSPDS()君藥，應(yīng)選擇黃芪甲苷作為指標(biāo)成分，本研究根據(jù)現(xiàn)代色譜分析技術(shù)程度，建立JSPDS成品的RPHPLELSD法指紋圖譜分析方法，更加全面地評價(jià)其質(zhì)量1。1儀器與試藥1.1儀器Agilentl100高效液相色譜儀，Alheh2000型蒸發(fā)光散射檢測器，AgilentheSatinfrLandLSsystes色譜工作站；BP一211D型電子分析天平

17、(德國Satritxs公司)。1.2試藥1.2.1健腎解毒腹膜透析液的制備先將黃芪、丹參、大黃3種藥材分別用煎煮、柱層析、有機(jī)溶劑提取等提取別離方法制備成各自的中間體，再將3種藥材中間體按一定比例參加其他藥物制備成健腎解毒腹膜透析液制劑2。1.2.2其他試藥黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0781202211)；乙腈(色譜純，erk公司)；重蒸餾水；其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1色譜條件LihrARTHPL-KartusheRP-18e色譜柱(25046，5)；流動相A-乙腈，B-水，梯度洗脫見表1。流速0.80l/in，進(jìn)樣量20l，柱溫25，ELSD參數(shù)漂移管溫度10

18、6，氮?dú)饬魉?.00l/in，理論板數(shù)以黃芪甲苷計(jì)算不低于4000。表1乙腈水梯度洗脫略2.2參照物峰的選擇與參照物溶液的制備因黃芪甲苷為有效部位指標(biāo)性成分，且在HPL指紋圖譜中黃芪甲苷的色譜峰面積較大、穩(wěn)定，應(yīng)選擇黃芪甲苷的色譜峰為參照物峰3，計(jì)算其它色譜峰的相對保存時(shí)間和相對峰面積。精細(xì)稱取黃芪甲苷對照品10.03g,置于10l量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含黃芪甲苷1.003g的參照物溶液。2.3供試品溶液和陰性對照溶液的制備與測定按處方精細(xì)稱取JSPDS()凍干粉適量，加水適量溶解并稀釋，用0.45微孔濾膜過濾，即得供試品溶液(2gL)，同法制得陰性對照溶液。分別汲取

19、供試品溶液、參照物溶液及陰性對照溶液各20l，注入高效液相色譜儀，記錄60in色譜圖，陰性對照溶液的色譜圖無干擾。2.4方法學(xué)考察2.4.1精細(xì)度實(shí)驗(yàn)取JSPDS同一供試品溶液，連續(xù)注入高效液相色譜儀5次，考察各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的RSD均小于3，精細(xì)度良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求4。2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批JSPDS分別制備供試品溶液6份，分別注入高效液相色譜儀，考察各色譜峰相對保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的RSD均小于3，重復(fù)性良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求。2.4.3穩(wěn)定性實(shí)

20、驗(yàn)取同一JSPDS供試品溶液，分別在0，2，4，8，16h時(shí)，室溫(25)下檢測，考察各色譜峰相對保存時(shí)間、峰面積比值的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，JSPDS()供試品溶液16h內(nèi)，各色譜峰相對保存時(shí)間和峰面積比值的RSD均小于3，穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜規(guī)定要求。2.510批JSPDS()試品指紋圖譜根據(jù)10批JSPDS試品的檢測結(jié)果，比擬其特征色譜圖(見圖1)，確定各批JSPDS()共有的、相對穩(wěn)定的7個(gè)色譜峰為共有峰，10批試品相對保存時(shí)間見表2。共考察10批JSPDS成品指紋圖譜，選擇7個(gè)色譜峰為共有峰，其保存時(shí)間峰號分別約為1.484in(1)，4.420in2，12.154in3，12.

21、983in4，15.353in5，16.847in6，27.719in7，S。其中，黃芪甲苷為7號峰，為S峰。測試條件下，l0批JSPDS供試品檢測結(jié)果說明：主要共有峰面積比值為234567(S)=0.2100.390.2720.5040.1370.2550.1300.2420.08260.1531.000。共有峰面積占總峰面積比值(見表3)均大于95，非共有峰面積占總峰面積比值均小于5，符合指紋圖譜規(guī)定要求5。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件A版(中國藥典委員會推薦)分析評價(jià)相似度。共測定l0批JSPDS的RPHPLELSD指紋圖譜，相似度均大于0.900，符合指紋圖譜要求(0.900

22、1.000)。表210批JSPDS()指紋圖譜評價(jià)結(jié)果(相對保存時(shí)間)略表310批JSPDS()主要共有峰峰面積比值略3討論黃芪藥材及制劑的指紋圖譜研究已有少量相關(guān)報(bào)道68，然而JSPDS()是一種新制劑，除了黃芪外還包含其他有效成分，以往文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件并不適用于JSPDS()914。本次研究采用的方法適用于JSPDS()，可有效地控制其質(zhì)量，為研制平安有效的JSPDS()提供了新的實(shí)驗(yàn)基矗指紋圖譜相似度的評價(jià)方法有歐氏間隔 法、絕對間隔 法、insky間隔 法、夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法以及峰匹配度法等6種5，1516，相比擬而言，峰匹配法能較靈敏地檢測小峰個(gè)數(shù)波動，歐氏間隔 測定法那么具有

23、較好的綜合評價(jià)才能，夾角余弦法對于檢測指紋圖譜間譜峰比例關(guān)系的變動較為適宜，因此，更適于分析評價(jià)不同批次間藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性。故在建立指紋圖譜分析方法中選擇夾角余弦法評價(jià)JSPDS藥材、中間體和成品的相似度。在建立JSPDS成品的指紋圖譜實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用了梯度洗脫的方法，較好地使每個(gè)色譜峰得到根本別離。因ELSD漂移管溫度和N2流速等參數(shù)不能隨著流動相比例的變化設(shè)定，故應(yīng)用HPL-ELSD法進(jìn)展梯度洗脫，與HPL-DAD法相比有局限性，流動相比例變化不能太大，參數(shù)的設(shè)定一般以梯度洗脫中極性較大的流動相為主要參考。實(shí)驗(yàn)說明，在指紋圖譜研究中，由于中藥成分復(fù)雜，使用等度洗脫系統(tǒng)往往難以得到反映全組分指紋特征的HPL色譜圖。在對JSPDS()指紋圖譜研究中，采用了梯度洗脫方法，使色譜峰得到較好的別離。找到適宜的梯度洗脫系統(tǒng)是JSPDS()指紋圖譜方法建立的關(guān)鍵。致謝：在本課題完成過程中，得到傅曉晴教授、陳鼎雄主任藥師的悉心指導(dǎo)及大力支持，在此表示衷心的感謝！【參考文獻(xiàn)】1任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用J.中藥新藥與臨床藥理，2002，123：135.2陳丹,劉文英,王二麗.健腎