植物生理實(shí)驗(yàn)二

1、實(shí)驗(yàn)二 硝酸還原酶活性的測定1一、目的 硝酸還原酶（nitrate reductase，縮寫NR）是硝酸鹽同化中第一個酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置。它與植物吸收利用氮肥有關(guān)，對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，因而硝酸還原酶活性被當(dāng)作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。通過本實(shí)驗(yàn)可以初步掌握測定硝酸還原酶活性的原理和方法。2二、原理在一定條件下，NO2-的生成量與硝酸還原酶活性呈正相關(guān)。NO2-含量可用磺胺顯色法測定，即在酸性條件下與對-氨基苯磺酸胺發(fā)生重氮反應(yīng)，生成的重氮化合物又與N-萘基乙二胺鹽酸鹽（或-萘胺）生成紅色偶氮化合物，可在520nm下比色測定。反應(yīng)如

2、下：34 離體法需將材料磨成勻漿，經(jīng)過濾或離心除去殘?jiān)?，以上清液為硝酸還原酶粗酶液進(jìn)行測定。由于研磨中NADH受損失，必需外加NADH方可測定。 活體法直接用鮮活組織進(jìn)行測定。環(huán)境中的NO3-進(jìn)入細(xì)胞后，被硝酸還原酶還原成NO2-并擴(kuò)散到細(xì)胞外在溶液中積累，測定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸還原酶活性的大小。5 活體法不破壞細(xì)胞原有的酶反應(yīng)系統(tǒng)，NADH可由代謝反應(yīng)不斷生成，無需外加?；铙w法簡便、快速，不需要貴重儀器設(shè)備及低溫條件，但重復(fù)性欠佳，應(yīng)作一定量的重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用活體法測定硝酸還原酶活性。6三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1材料 材料可選用小麥、玉米、白菜、油菜、煙葉等作物的葉片2儀器（1

3、）天平（2）真空泵和真空干燥器（3）離心機(jī)（4）20mL試管7（5）50mL三角瓶3（6）恒溫水?。?）恒溫箱（8）分光光度計(jì)（9）移液管：5mL2；2mL5；1mL173試劑（1）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：（2）0.1mol/L pH7.5磷酸緩沖液：A液（0.2mol/L Na2HPO4）B液（0.2mol/L NaH2PO4）取A液84.0mL和B液16.0mL，混勻，加蒸餾水100mL。（3）0.04mol/L KNO3：（4）1%對氨基苯磺酸：（5）0.2% 萘胺：（6）30%三氯乙酸：8四、操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支干凈試管，編號，按表1加入試劑：搖勻后在室溫下放置30min，然后在5

4、20nm波長下測定光密度，以亞硝酸含量和光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9試劑試管號123456亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.201%對氨基苯磺酸2.02.02.02.02.02.00.2% 萘胺2.02.02.02.02.02.0亞硝酸鈉含量（g ）0 1 2 3 4 5表一標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取樣表102酶反應(yīng)和酶活性的測定 將實(shí)驗(yàn)材料用水洗凈，再用蒸餾水沖洗，然后用紗布或?yàn)V紙吸干。將材料剪成0.5cm 0.5cm左右的小塊，混合均勻后分別稱取三份，每份0.4g，然后分別放入3只50mL的三角瓶中，編號后按表2加入各種試劑：1112 搖勻后將

5、三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣10-15min。放氣后葉片變軟并沉入溶液。將三角瓶取出放入恒溫箱，在30、暗條件下保溫30min。取出后立即向2、3號瓶分別加入1mL 30%三氯乙酸以終止酶反應(yīng)。13將各瓶中的反應(yīng)液離心（2 000r/min，10min）（根據(jù)情況，可以省略），然后分別吸取上清液1mL于另一試管中，各加入2mL 1%對氨基苯磺酸和2mL 0.2% -萘胺（注意順序），室溫顯色30min后測定520nm波長下的光密度。用2、3號管溶液光密度平均值減去1號管溶液的光密度，得到的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的NaNO2含量（g）。14五、結(jié)果與計(jì)算把在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的NaNO2含量代入下式，計(jì)算硝