抗原沖擊致敏樹突狀細胞誘導特異性CTL殺傷Jurkat細胞實驗研究

1、抗原打擊致敏樹突狀細胞誘導特異性CTL殺傷Jurkat細胞實行研究林東軍，方志剛，李旭東，劉加軍，陸英【摘要】本研究以康健人外周血單核細胞為前體細胞，體外誘導其為樹突狀細胞D，別離負載Jurkat細胞凍融抗原及T1多肽抗原，產生特異性細胞毒性T淋巴細胞TL，以探究其對白血病Jurkat細胞的殺傷作用。團結應用rhG-SF、rhIL-4、rhTNF-及rhsD40L等細胞因子，密度梯度離心法、貼壁法從外周血獵取單核細胞并舉行誘導擴增，造就出D，別離用凍融抗原及T1多肽抗原打擊致敏D。實行分4組：凍融抗原致敏D組為實行組A，T1多肽致敏D組為實行組B，未致敏D組為比較組A，單核細胞組為比較組B，不

2、雅察TL對Jurkat細胞的殺傷作用。結果表白：造就出了具有典范特性的D，它高表達D40、D80、D1a及D86等外貌標識表記標幟，能體外誘導猛烈的同種異基因混淆淋巴細胞增殖反響。實行組表現(xiàn)高程度殺傷率，與比較組比力均具有統(tǒng)計學意義P0.01，實行組A、B間比力無統(tǒng)計學意義。結論：Jurkat細胞凍融抗原及T1多肽抗原打擊致敏D能有用誘導T細胞抗白血病作用，為臨床研制D疫苗提供了實行根據(jù)?！娟P鍵詞】樹突狀細胞；Jurkat細胞；凍融抗原；T1多肽抗原；細胞毒作用；白血病Antigen-ladedDendritiellsTriggerKillingEffetsfSpeifiyt-txiTLyph

3、ytesnJurkatellsInVitrAbstratThisstudyasaiedtinvestigatetheeffetsfturantigen-ladeddendritiells(D)stiulatingthespeifiyttxiTlyphytes(TL)nJurkatellsinvitr.PeripheralbldnnulearellsereislatedbyFilldensitygradiententrifugatinfrnralhuanheparinizedbld，theadherentnytesereulturedithgranulyte-arphagelnystiulati

4、ngfatr(G-SF)，interleukin-4(IL-4)，alphaturnersisfatr(TNF-)andsD40L，Dsere-ulturedithfrzen-thaedantigenfJurkatellsrT1peptides，andthenTellseretriggeredintspeifiTL.TheresultsshedthatstsuspendedellsexhibiteddistintiverphlgialfeaturesfDhihexpressedD40(96%)，D86(97%)，D80(77%)，D1a(69%)，andgainedtheperfulapait

5、ytstiulateprliferatinfallgenEilyphytes.Undertheeffetrtargetratif201，TLsderivedfrulturesithDandfrzen-thaedantigenfJurkatellsshed91.1%yttxiityagainstJurkatells，TLderivedfrulturesithDandT1peptidesshed87.5%yttxiityagainstJurkatells，yttxiityfTLderivedfrulturesithunladedDagainstJurkatellsas42.1%andyttxiit

6、yfnytesas22.7%.yttxiityfTLderivedfrultureithfrzen-thaedantigenrT1peptidesladedDasstrngerthanthatinntrlgrupsP0.01.Itisnludedthattheturantigen-pulsedDanindueeffiientandspeifianti-turiunity，ayplayagreatrleinlinialtherapyfrleukeia.Keyrdsdendritiell;Jurkatell;frzen-thaedantigen;T1plypeptide;yttxiity;leuk

7、eia樹突狀細胞(dendritiell，D)是體內成效最強的專職抗原呈遞細胞，最大特點是能刺激初始型T細胞活化和增殖，是特異性免疫應答的始動者，D在抗腫瘤免疫反響中起關鍵作用。但大多數(shù)白血病患者有D成效缺陷，在體外擴增D并誘導白血病特異性細胞毒性T細胞發(fā)揮最大限度特異性抗白血病效應，使消除白血病病灶、延伸患者壽命、防范復發(fā)成為大概。本實行應用細胞因子rhG-SF、rhIL-4、rhTNF-及rhsD40L等由康健人外周血單核細胞(nytes)誘導活化出D，使其別離負載Jurkat細胞凍融抗原及T1多肽抗原(ilsturantigen，T1)，體外誘導產生特異性細胞毒性T細胞yttxiTlyp

8、hyte，TL，不雅察TL對Jurkat細胞的特異性殺傷效應，為D疫苗在白血病免疫治療中的臨床應用提供實行根據(jù)。質料和要領重要試劑及儀器rhG-SF、rhIL-4、rhTNF-、rhsD40L均購自美國ytlab公司；鼠抗人FIT-D14、D1a、D40、D80、D83、PE-D86等流式細胞熒光標識表記標幟抗體美國eBisiene公司產物；LDH-yttxiity闡發(fā)(美國Bivisin公司產物)；NiknTE2000-U倒置顯微鏡(日本Nikn產物；del680型酶標儀美國Bi-Rad公司產物;FASalibur流式細胞儀美國BetnDikinsn公司產物。急性T淋巴細胞白血病細胞株Jur

9、kat為T1基因+細胞系本院血液室保存，RT-PR檢測T1基因陽性。單核細胞泉源的D的體外誘導造就及斷定網羅奇怪抗凝康健人外周血，用淋巴細胞分散液分散得到單個核細胞(nnulearells)，以含10%胎牛血清FBS的RPI1640造就液調解細胞濃度為3109/L，接種于25l塑料造就瓶，在5%2飽和濕度、37條件下孵育3小時，吸出非黏附細胞，用預熱的造就液洗去未貼壁的細胞，即得到貼壁的單核細胞nytes。參加含10%FBS的RPI1640造就液含rhG-SF100g/L，rhIL-450g/L，2l/LL-谷氨酰胺，在5%2、37條件下造就，第3、5天半量換液，劃一量添加上述細胞因子，在第5

10、天網絡懸浮細胞于6孔板造就，并添加rhTNF-20g/L，rhsD40L2g/L。第7天勞績細胞，瑞氏染色并攝片，流式細胞儀檢測免疫表型?；煜馨图毎错?LR)網絡上述要領中得到的非貼壁單個核細胞淋巴細胞，參加RPI1640(含rhIL-220000U/L低濃度造就)，每2-3天半量換液，造就7天作為反響細胞;刺激細胞為向D誘導的細胞，網絡造就第7天的D懸液，離心。同種異基因混淆淋巴細胞反響組為實行組，與同種同基因淋巴細胞反響組為比較組。TT法檢測淋巴細胞增殖活性：D與淋巴細胞比例別離為110，120，1100淋巴細胞濃度為2109/L，各0.1l接種于96孔板，混和孵育72小時，加TT10

11、l(5g/L)再作用4小時，酶標儀檢測波長490n的A值。Jurkat細胞凍融抗原制備和T1多肽合成及抗原打擊致敏D網絡Jurkat細胞，生理鹽水洗滌，調解細胞濃度為1109/L，安排-70冰箱10分鐘，37水浴復溫，重復凍融5次，500g離心10分鐘，網絡上清，10000g低溫離心30分鐘，取上清用0.22微孔濾膜過濾，-20冰箱保存?zhèn)溆?；選用T1卵白第126-134位9個氨基酸殘基的多肽，氨基酸序列為RFPNAPYL，由上海生工公司合成，HPL純度檢測95%，分子量1108.3，取5g溶于5lPBS中，分裝，-20冰箱保存?zhèn)溆?。在D造就的第4天每毫升造就體系實行組別離加Jurkat細胞凍融

12、抗原及T1多肽50l，作用24小時，RPI1640造就液洗滌，重新添加細胞因子繼承造就。IL-12含量的檢測及活化T細胞免疫表型檢測網絡誘導造就的第7天D上清，用ELISA法定量檢測IL-12的含量，詳細操縱按試劑盒(法國Dilne公司產物)說明書舉行。網絡上述要領中分散得到的非貼壁異體單個核細胞，用含IL-220000U/L的RPI1640造就液造就7天，加D繼承誘導造就72小時，D與淋巴細胞濃度比為120。D誘導的T細胞表型為實行組，未經D誘導的T細胞表型為比較組，網絡造就的細胞懸液，洗滌、離心后加PBS懸浮，參加D3、D4、D8及D28熒光抗體，用流式細胞儀檢測。細胞毒作用的乳酸脫氫酶L

13、DH開釋法測定網絡上述要領造就的活化T細胞作為效應細胞，取傳代后24小時的Jurkat細胞為靶細胞，效靶比為51、101、201。實行分4組：實行組A：Jurkat細胞凍融抗原打擊致敏D+異體淋巴細胞+Jurkat細胞；實行組B：T1多肽抗原打擊致敏D+異體淋巴細胞+Jurkat細胞；比較組A：未致敏D+異體淋巴細胞+Jurkat細胞；比較組B：單核細胞+異體淋巴細胞+Jurkat細胞。LDH開釋法測定細胞毒效應，按LDH-yttxiity試劑盒說明書操縱，酶標儀檢測波長490n處的A值，參考波長為630n。細胞殺傷活性盤算：細胞毒%=實行組A值-低控組A值/高控組A值-低控組A值100%統(tǒng)計

14、學處置懲罰SPSS11.0軟件舉行統(tǒng)計學闡發(fā)，數(shù)據(jù)用XSD表現(xiàn)，兩組資料接納t查驗，P0.05為有統(tǒng)計學意義。結果外周血D的誘導擴增及斷定造就48小時后，懸浮細胞增多，第4-5天，多數(shù)細胞呈懸浮生長，并聚攏成團，細胞體積顯著增大，圓形或不規(guī)矩形，外貌有毛刺樣突起。第7天懸浮細胞較散在漫衍，細胞體積大，毛刺、樹枝樣突起增多、變長圖1A。瑞氏染色RG可見細胞體積大，直徑約15-35，呈圓形、不規(guī)矩形，外貌有偽足樣突起圖1B。流式細胞儀檢測D86達97%，D40達96%，D80均勻為77%，D1a均勻為64.62%，D83均勻為40%，而單核細胞特性性標識表記標幟D145%圖2，表白經細胞因子誘導后

15、絕大部門單核細胞轉釀成了D?；煜馨图毎错懡Y果結果見表1。D與同種同基因或同種異基因淋巴細胞按差異比例混淆都可產生增殖反響，120，110比例下，兩組比力均具有統(tǒng)計學意義P0.05。在110時增殖反響最強，這表白經細胞因子誘導得到的D具有強的免疫原性，具有更強的刺激同種異基因淋巴細胞增殖反響的本領，且隨著D細胞數(shù)的增多，刺激同種異基因淋巴細胞增殖反響的本領加強。Table1.PrliferativerespnseafterixturefDithautgeneiandallgeneilyphytes略活化T細胞免疫表型及IL-12的含量檢測結果見表2。由表2可見經D引發(fā)的T細胞有顯著上調D3、

16、D4、D8、D28分子的作用因檢測例數(shù)少，未進一步作統(tǒng)計學闡發(fā)。ELISA法定量檢測IL-12的含量為61g/L。Table2.PhentypefTlyphyteseffetedbyD略致敏D誘導TL細胞毒作用的不雅察用LDH開釋法檢測TL的細胞毒效應，結果見表3。用配對t查驗，對實行組A、實行組B及比較組A、比較組B在各差異效靶比下的殺傷率作兩兩比力，在任一結實效靶比例下，實行組A、B與比較組A、B兩兩比力，差異均具有統(tǒng)計學意義P0.01。實行組A、B間兩兩比力P0.05不具有統(tǒng)計學意義。這些結果表白，經抗原致敏D能明顯加強TL對Jurkat細胞的殺傷作用。Table3.Frzen-thae

17、dantigenandT1peptide-ladedDtriggeringTLediatedkillingeffetsnJurkatell略討論比年來研究證明，D被種種情勢的腫瘤抗原致敏后可以在體表里誘導出腫瘤特異性TL1-5，如今使用D舉行腫瘤免疫治療已進入臨床試驗階段。G-SF與IL-4團結應用可誘導單核細胞成為具有未成熟表型的D，再予必然的刺激信號作用，如TNF-、D40L等細胞因子，可誘導出成熟D，使其抗原呈遞成效到達最正確狀態(tài)。D40L是人類D成熟緊張刺激信號，sD40L在體外不但具有明顯的誘導D分化、促進D成熟的成效，并且經sD40L作用的D能更有用地引發(fā)T細胞6，sD40L有盼望

18、成為制備高效D疫苗的緊張細胞因子。D40L與D外貌的D40彼此作用后能誘導D的分化成熟7-9，上調共刺激分子的表達，且D40-D40L的彼此作用誘導D排泄一系列細胞因子和趨化因子，如IL-12、TNF-、IP-等。IL-12重要泉源于D的排泄，其成效重要是操縱D4+T細胞向Th1細胞亞群的分化，誘導產生INF-，在體液抗腫瘤免疫方面發(fā)揮緊張作用。1990年all等16從ils瘤細胞中分散出T1基因，其基因定位于染色體11P13，編碼龐大的RNA，由于其2個可變毗連區(qū)的變革，可產生4種差異的轉錄產物。比年來研究創(chuàng)造，在正常造血體系及造血體系惡性腫瘤中T1基因有差異表達，在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌

19、等中高表達。接納RT-PR技能檢測T1基因的表達，創(chuàng)造在AL、ALL及L急性變中有高表達11，12。T1多肽是已經斷定出的白血病多肽。hinani等9用T1多肽致敏T細胞后，后者對HLA-A24陽性白血病細胞株具有特異性的細胞毒作用。T1多肽致敏的D通過誘導細胞毒T細胞對表達T1基因的急性白血并慢性白血并骨髓增生非常綜合征和實體瘤等腫瘤細胞產生殺傷效應，故可用于白血并實體瘤的免疫治療13-15。我們從康健人外周血中分散出單核細胞，經誘導造就出具有典范樹突狀形態(tài)特性的D，它高表達D86最高達97%、D80、D40最高達96%及D1，表達D83均勻為40%，混淆淋巴細胞反響提示其具有極強的免疫原性

20、。在D造就至未成熟階段，用Jurkat細胞凍融抗原及T1多肽抗原致敏D，繼而參加TNF-、sD40L，使D趨于成熟，誘導激活T細胞，引起特異性抗腫瘤效應。打擊致敏D誘導引發(fā)的TL在凍融抗原及T1多肽抗原差異效靶比下對Jurkat細胞的殺傷率均高于單純D組和單核細胞比較組(P0.05)，且在每一組中，它們所引發(fā)的TL殺傷活性均隨著效靶比的進步而相應進步，表現(xiàn)了殺傷活性的量效干系，說明D已樂成攝取了凍融抗原或T1多肽抗原，加工后經H類分子呈遞給淋巴細胞，同時通過共刺激分子、黏附分子等將T細胞激活，對白血病細胞產生了特異性殺傷作用。此中未致敏D、單核細胞組表現(xiàn)出必然的殺傷效應，它們對白血病細胞黑白特

21、異性殺傷，以是服從較低。實行組A、B間兩兩比力P0.05不具有統(tǒng)計學意義，可見T1多肽抗原單一腫瘤細胞特異性抗原與Jurkat細胞凍融抗原得到全腫瘤細胞抗原所激活的TL對Jurkat靶細胞殺傷效應相稱，這也不失為有用負載腫瘤抗原的要領，此兩種要領都具有臨床應用代價，為進一步應用于免疫治療的體內實行奠基了基矗我們只合成此中一種T1多肽負載D，至于別的3種多肽抗原負載D可否誘導出更強的TL，尚需進一步研究。的抗原不必然能誘導出最正確抗腫瘤免疫反響。一種抗原負載D，其長處在于誘發(fā)的免疫反響特異性強，但是誘發(fā)的僅是單一克隆的TL，結果有限，存在誘發(fā)抗原調變的傷害。凍融抗原所獵取的抗原信息量大，可提供多

22、種和未知腫瘤特異性或相干性抗原，誘導T細胞多克隆擴增，制止產生某些變異株的免疫逃逸，包管抗腫瘤免疫的全面性和強效性；缺點是特異性抗原純度底，對D的負載結果相對較不特異。固然Jurkat細胞凍融抗原和T1多肽抗原打擊致敏D激活TL，體外對Jurkat細胞產生顯著殺傷效應，但是在體內結果怎樣有待進一步研究。致敏D誘導TL細胞毒作用的不雅察用LDH開釋法檢測TL的細胞毒效應，結果見表3。用配對t查驗，對實行組A、實行組B及比較組A、比較組B在各差異效靶比下的殺傷率作兩兩比力，在任一結實效靶比例下，實行組A、B與比較組A、B兩兩比力，差異均具有統(tǒng)計學意義P0.01。實行組A、B間兩兩比力P0.05不具

23、有統(tǒng)計學意義。這些結果表白，經抗原致敏D能明顯加強TL對Jurkat細胞的殺傷作用。Table3.Frzen-thaedantigenandT1peptide-ladedDtriggeringTLediatedkillingeffetsnJurkatell略討論比年來研究證明，D被種種情勢的腫瘤抗原致敏后可以在體表里誘導出腫瘤特異性TL1-5，如今使用D舉行腫瘤免疫治療已進入臨床試驗階段。G-SF與IL-4團結應用可誘導單核細胞成為具有未成熟表型的D，再予必然的刺激信號作用，如TNF-、D40L等細胞因子，可誘導出成熟D，使其抗原呈遞成效到達最正確狀態(tài)。D40L是人類D成熟緊張刺激信號，sD4

24、0L在體外不但具有明顯的誘導D分化、促進D成熟的成效，并且經sD40L作用的D能更有用地引發(fā)T細胞6，sD40L有盼望成為制備高效D疫苗的緊張細胞因子。D40L與D外貌的D40彼此作用后能誘導D的分化成熟7-9，上調共刺激分子的表達，且D40-D40L的彼此作用誘導D排泄一系列細胞因子和趨化因子，如IL-12、TNF-、IP-等。IL-12重要泉源于D的排泄，其成效重要是操縱D4+T細胞向Th1細胞亞群的分化，誘導產生INF-，在體液抗腫瘤免疫方面發(fā)揮緊張作用。1990年all等16從ils瘤細胞中分散出T1基因，其基因定位于染色體11P13，編碼龐大的RNA，由于其2個可變毗連區(qū)的變革，可產生4種差異的轉錄產物。比年來研究創(chuàng)造，在正常造血體系及造血體系惡性腫瘤中T1基因有差異表達，在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌等中高表達。接納RT-PR技能檢測T1基因的表達，創(chuàng)造在AL、ALL及L急性變中有高表達11，12。T1多肽是已經斷定出的白血病多肽。hinani等9用T1多肽致敏T細胞后，后者對HLA-A24陽性白血病細胞株具有特異性的細胞毒作用。T1多肽致敏的D通過誘導細胞毒T細胞對表達T1基因的急性白血并慢性白血并骨髓增生非常綜合征和實體瘤等腫瘤細胞產生殺傷效應，故可用于白血并實體瘤的免疫治療13-15。我們從康健人外周血中分散出單核細胞，經誘導造