生物素親和素系統(tǒng)相關技術

1、關于生物素親和素系統(tǒng)相關技術第一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點第二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一）生物素及活化生物素(一)生物素1 概念： 生物素(biotin)是動、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31第三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月3.結構： （CH2）4COOH 結合親和素結合蛋白質咪唑酮環(huán)噻吩環(huán)第四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月whywhywhy為什么要

2、對生物素進行活化？為什么要對生物素進行活化？第五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月我是生物素我可以是抗體，也可以是酶第六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月我是親和素，我來了第七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月Broken Heart第八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月我是親和素，我來了第九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月 1）生物素分子較小，與蛋白質結合后，由于大分子蛋白質的空間位阻效應，可影響生物素與親和素間的結合； 2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質上的氨基結合。 因此，活化生物素可克服以上缺點，既減少空間位阻效應，又可擴大其結合的對象。(二)活化生物素第十

3、張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月生物素與蛋白質的結合第十一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.標記蛋白質氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）。 2.標記蛋白質醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。 3.標記蛋白質巰基：3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 4.標記核酸：光生物素、生物素脫氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。 第十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.標記蛋白質氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）。 抗體中性和偏堿性蛋白的標記第十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月2

4、.標記蛋白質醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ） 用于偏酸性糖蛋白的生物素標記第十四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月標記對象： 大分子活性物質：如抗原、抗體。標記后不影響免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。會降低ALP的活性。(三)生物素標記蛋白質第十五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月活化生物素可與不同的大分子物質結合，應根據(jù)可標記基團的種類及特性，選擇相應的活化生物素； 抗體：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素第十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一個蛋白質分子可聯(lián)結多個生物素分子，即生物素化大分子具有多價性，它是BAS多級放大

5、作用的物質基礎。但每個蛋白質上標記的生物素分子數(shù)量應控制在一定范圍。 每個抗原標記1-3個生物素分子為宜； 每個抗體標記3-5個生物素分子為宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果較好。第十七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點第十八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二）親和素和鏈霉親和素(一) 親和素(avidin，A) 1.概念：是動物微生物中提取的一種含10%碳 水化物的堿性糖蛋白。 2.分子量：68 0003.結構：4個相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，

6、它是與生物素結合的基團。第十九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月A4.特性：每個亞基都可結合1個生物素分子，即1個親和素分子可結合4個生物素分子。5.親和常數(shù)：1015/mol6.缺點：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會導致本底增大，降低檢測靈敏度。第二十張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二）親和素和鏈霉親和素(二)鏈霉親和素(streptavidin，SA) ：1.概念：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質。2.分子量：65 0003.結構：由4個相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大 。第二十一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月4

7、.特性：1個親和素分子可結合4個生物素分子。5.親和常數(shù)：1018/mol6.優(yōu)點：為弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠低于親和素，因此應用廣泛。SA第二十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月標記對象： 大分子物質：如酶、抗原和抗體。 小分子物質：膠體金、FITC和化學發(fā)光物等。二）親和素和鏈霉親和素(三 ) 親和素的標記 第二十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一) 生物素及活化生物素二) 親和素及鏈霉親和素三) 生物素-親和素系統(tǒng)的特點第二十四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月三）生物素-親和素系統(tǒng)的特點

8、1.特異性強： 親和素和生物素間的高親和力。2.靈敏度高： 每個親和素分子可與四個生物素結合； 生物素化大分子具多價性。3.快速、穩(wěn)定：4.應用廣泛： 可與酶、熒光素、膠體金等多類標記技術結合；第二十五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月 可有Ag與Ab反應的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在此基礎上引入A-B系統(tǒng)。BAB法：BA法：ABC法：二、 BAS的基本類型及原理第二十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月BAB法： AbB A AbB-A B AbB-A-B 特點：以游離A分別連接B-Ab和B-E；AbB和A-B的兩次放大效應，可提高靈敏度。 第二十七張，PPT共四十

9、頁，創(chuàng)作于2022年6月+A+A+BAB法在夾心ELISA中的應用第二十八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月BA法： AbB A AbB-A 特點：省略加標記生物素步驟，操作較BAB法簡便；AbB的放大效應，該法有相當高的靈敏度。第二十九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月+A-EBA法在間接ELISA中的應用第三十張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月ABC法： A+B A- B -ABC Ag+AbB Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特點：是在BAB法基礎上的改良，將BAB法中的A先與B-E結合，制備成復合物ABC；操作比BAB法簡便，但仍然保持較高的靈敏度。第三十

10、一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月+ABCB-E + A ABCABC法在夾心ELISA中的應用第三十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、BAS在酶免疫技術中的應用2、BAS在熒光免疫技術中的應用3、BAS在放射免疫技術中的應用4、 BAS在分子生物學中的應用三、 生物素-親和素系統(tǒng)的應用第三十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫-PCR 免疫PCR是在ELISA的基礎上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。 PCR具有很強的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結合的特異抗體通過連接分子與DNA

11、結合，再經(jīng)PCR擴增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。 第三十四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫-PCR一、主要程序1. 抗原+生物素化抗體抗原-生物素化抗體復合物； 2. 加親合素抗原-生物素化抗體-親合素復合物； 3. 加生物素化DNA抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA； 4. PCR擴增生物素化DNA部分。 第三十五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR擴增原理引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火第三十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術具有高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍第三十七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、免疫PCR的發(fā)展 免疫PCR技術目前尚處于研究階段，應用的還不多； 實驗表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號很弱，可以檢測到幾百個分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。 第三十八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月在報