流式細(xì)胞術(shù)實驗中處理樣本方法

1、Word文檔 流式細(xì)胞術(shù)實驗中處理樣本方法 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）能夠快速測定細(xì)胞懸液中單個細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，并可以對特定的細(xì)胞進(jìn)行分選收集。廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。接下來的 Protocol 中以小鼠的淋巴細(xì)胞為例進(jìn)行細(xì)胞表面和胞內(nèi)染色。 一. 試劑預(yù)備Wash Buffer：PBS+1% FBS破膜劑（ICS）：用雙蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。破膜固定劑：將配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀釋 100 倍ICS Wash Buffer：將配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀釋 100 倍。二. 細(xì)胞表

2、面染色收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，加入適量 Wash Buffer 液洗滌，1500 rpm 離心 5 min，去上清，加入 50 l Wash Buffer 重懸。（可選）Live dead 染色，每管加 0.1 L Zombie GreenTM Dye（樣品多時使用時可先稀釋），震蕩混勻，室溫避光孵育 1015 min。Wash Buffer 液洗滌，1 500 rpm 離心 5 min，棄上清。封閉 Fc 受體：每管中加入 1 g/106 細(xì)胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗體封閉熒光抗體 Fc 受體引起的非特異性染色。震蕩混勻，4 孵育 30 min（或室溫避光 15 m

3、in）。Wash Buffer 液洗滌，1 500 rpm，離心 5 min，棄上清。用適量體積 Wash Buffer 液重懸每個樣本，將各組細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)混合后分裝到單染管和不染抗體管，作為流式檢測時調(diào)整電壓。單染管中加入相應(yīng)表面染色抗體，同時在每個樣本中加入 1 L percp CD3/106 細(xì)胞和 0.5 L PE CD4/106 細(xì)胞，震蕩混勻，4 避光孵育 30 min（或室溫避光 15 min）。用 Wash Buffer 液洗滌，1500 rpm 離心 5 min，棄上清。打孔或者加入 200 L 1% PFA（多聚甲醛）固定過夜。三. 胞內(nèi)染色將全部管細(xì)胞固定打孔。每管加入

4、150 L 固定破膜劑，震蕩混勻，4 避光孵育 20 min。ICS Wash Buffer 液洗滌，用法同 Wash Buffer 液。在相應(yīng)的需要進(jìn)行胞內(nèi)染色的樣本中加入適當(dāng)量胞內(nèi)染色抗體（如 APC IFN-抗體），4 孵育 30 min 或室溫避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗滌，1 500 rpm 離心 5 min。棄離心上清液，依據(jù)實際狀況加入 200 L 或者 300 L Wash Buffer 液重懸。震蕩混勻，流式上機。四. 留意事項每一步離心倒掉上清時可以先在試驗臺上鋪幾層平板紙，傾倒上清后可吸掉管口的液體。為了避開打孔劑對細(xì)胞形態(tài)的影響從而影響后續(xù)圈門影響試驗結(jié)果，所以不管是否需要胞內(nèi)染色，每個樣本都需要打孔。染色時抗體的加入量可依據(jù)實際狀況調(diào)整，為避開抗體濃度對染色的影響，樣品染色體系不得大于 100 L。為削減染色時加樣的誤差，可配置表面染色抗體稀釋液，雙染或多色染色可把多種抗體稀釋到一管中。按 10 L 或 5 L 體系，用 Wash Buffer 液稀釋。為了避開游離抗體的結(jié)合消失假陽