分子生物學(xué)技術(shù)在食品生物安全方面的應(yīng)用

1、基因檢測(cè)技術(shù)在 在食品生物安全領(lǐng)域的應(yīng)用祝 長(zhǎng) 青江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局食品質(zhì)量安全理化安全生物安全應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的主要方面轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 過敏原檢測(cè) 物種鑒別 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)二十世紀(jì)80年代初，美國(guó)最早對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行研究。首例轉(zhuǎn)基因生物（GMO）于1983年問世，轉(zhuǎn)基因作物(1986）批準(zhǔn)進(jìn)行田間試驗(yàn)，延熟保鮮番茄（1993）在美國(guó)批準(zhǔn)上市，開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)應(yīng)用的先例.到2010年，全世界的轉(zhuǎn)基因食物的種植面積預(yù)計(jì)將增至6000萬公頃，市場(chǎng)總收入將達(dá)到3萬億美元。我國(guó)的轉(zhuǎn)基因植物現(xiàn)狀番茄（華番1號(hào)）甜椒（抗病毒）矮牽牛（改變花色）木瓜（抗病毒）大米（抗蟲、抗病毒，尚未批準(zhǔn)）大斑蝶事件

2、Losey等（Losey et al., 1999）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Nature上發(fā)表后引起了很大的轟動(dòng)。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中用加有Bt玉米花粉的馬利筋葉片來喂飼大斑蝶幼蟲，加普通玉米花粉及不加玉米花粉的馬利筋葉片作為對(duì)照，結(jié)果說明喂飼加有Bt玉米花粉的馬利筋的幼蟲第二天死亡10%以上，4天后死亡44%，而對(duì)照全部存活。此外，對(duì)加有Bt玉米花粉的馬利筋攝取量小，幼蟲生長(zhǎng)緩慢，重量只有喂飼無花粉葉片的幼蟲的一半。從另外一角度也可能威脅大斑蝶的生存，在無轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物前，除草劑一般只能在作物種子萌發(fā)前噴灑一次。在種植抗除草劑作物后，就可在作物生長(zhǎng)期多次噴灑除草劑，殺死雜草而對(duì)作物無威脅，隨著多次除草劑的

3、噴灑，馬利筋就大量減少。由于大斑蝶的惟一的食物是馬利筋，隨著馬利筋大量減少，也就威脅到大斑蝶的物種的生存。 Pusztai土豆事件 英國(guó)研究所有位博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，年秋天在英國(guó)電視臺(tái)發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。此事首次引起國(guó)際轟動(dòng)。綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織組織了了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動(dòng)，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究生的畢業(yè)論文都無法答辯。 英國(guó)皇家學(xué)會(huì)對(duì)此非常重視，組織了同行評(píng)審，并于年月發(fā)表評(píng)論，指出的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤，即：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)

4、基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對(duì)食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動(dòng)物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，很少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差，未作雙盲測(cè)定；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無一致性等。 但此事已經(jīng)使GMO食品的安全性成為了全球民眾與各國(guó)政府的關(guān)注焦點(diǎn)。StarLink玉米事件 StarLink玉米，它是由Aventis于1996年培育出來的一種可能引起過敏的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，StarLink玉米與哮喘發(fā)作和其它一些過敏反應(yīng)有關(guān)。這種玉米含有一種來自常見土壤細(xì)菌-蘇云金芽孢桿菌的cry9C蛋白，cry9C蛋白能夠保護(hù)玉米免遭玉米鉆蟲和黑毛蟲的侵害。 StarLink玉米于

5、1998年被美國(guó)環(huán)境保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)用只能用于動(dòng)物喂養(yǎng)和非食物性產(chǎn)品上，但到了2000年，在墨西哥的玉米食品等中發(fā)現(xiàn)有cry9C的DNA片段。隨后歐盟、日本等國(guó)也發(fā)現(xiàn)了StarLink玉米污染食品的情況。轉(zhuǎn)基因水稻 1. 歐盟要求美國(guó)政府保證出口到歐盟地區(qū)的所有長(zhǎng)粒水稻中不含有未經(jīng)許可的轉(zhuǎn)基因水稻品系LL 601，該水稻品系是由拜耳公司研發(fā)的。歐盟表示，至少在今后6個(gè)月將要求進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)，而且可能會(huì)要求進(jìn)行附加檢測(cè)。日本和韓國(guó)也對(duì)此表示關(guān)注，一些媒體暗示政府可能會(huì)發(fā)出禁令。 2. 2006年2008年，歐盟、日本等國(guó)在中國(guó)出口的大米或米制品中檢測(cè)到有抗蟲轉(zhuǎn)基因大米的污染，這些品系在中國(guó)都沒

6、有得到允許商業(yè)化種植的許可。因此對(duì)中國(guó)出口的米及米制品加大抽查檢測(cè)力度。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 檢測(cè)技術(shù) 基因方法：Real-time PCR ，PCR DNA Microarray 蛋白檢測(cè)方法：ELISA, Quicktest strip 標(biāo)準(zhǔn)方法 5個(gè)ISO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 8 項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 12項(xiàng)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 4項(xiàng)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) Quicktest strip for Cry1Ab/Accontrol testpositivenegativePrimer annealing at 50-70CMelting of DNA at 95CPolymerisation at 72C1. Cycle2. C

7、yclePCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin ElmerPCR is an exponential process定性常規(guī)PCR 樣品制備 樣品核酸提取 PCR體系配置 PCR擴(kuò)增 凝膠電泳檢測(cè)只能進(jìn)行定性結(jié)果的判斷（是/否），具有一定主觀性。 實(shí)時(shí)熒光（Real time） PCR的原理 CT值 表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。圖 1.Rn與時(shí)間曲線 熒光

8、實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性 全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便，無需進(jìn)行凝膠電泳Real time vs 終點(diǎn)法熒光實(shí)時(shí)PCR的標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)實(shí)時(shí) PCR - TaqMan Technology國(guó)內(nèi)外常用的Real-time PCR 儀器Roche Light

9、Cycler 2.0Roche LightCycler 480Applied Biosystems 7500型PCR儀 Biorad iCyclerScreening targetsGene specific targetsConstruct specificEvent specific targetsLevels of specificity GMO sequencesLOWHIGHRecent Bt10 case demonstrates need for construct and event specific methods GMO熒光PCR檢測(cè)項(xiàng)目篩選檢測(cè) Target genes:

10、 CaMV 35S Promotor, Nos teminator , NptII等 品系特異性檢測(cè) GTS40-3-2 (RoundUp Ready Soybean), BT 63, Bt176, Mon 863等 內(nèi)標(biāo)基因： GOS，Lectin，PLD，Zein等本實(shí)驗(yàn)室的GMO檢測(cè)工作 國(guó)家認(rèn)監(jiān)委首批認(rèn)可的GMO檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 與轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)先的Eurofins/GeneScan合作成立 了基因檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 FoodScan； 利用LightCycler 1.2 多次參加英國(guó)CSL、APLAC 的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)全球水平測(cè)試，結(jié)果滿意。 與農(nóng)業(yè)部、中檢院等合作，利用 LightCycle

11、r 480完成了轉(zhuǎn)基因大米的國(guó)標(biāo)協(xié)同驗(yàn)證，結(jié)果滿意。 每年轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的接近8001000批次，項(xiàng)目多達(dá)5000余項(xiàng)。TT51外源基因的LC480檢測(cè)圖Error: 0.134Efficiency: 1.857Slope: -3.720Y Intercept: 41.62Error: 0.0570Efficiency: 1.958Slope: -3.426Y Intercept: 38.60PLD內(nèi)標(biāo)基因的LC480檢測(cè)圖 食品過敏原的檢測(cè)最常見的食品過敏源Major serious allergens include 主要嚴(yán)重的過敏源包括 (IFST-1999):“Big eight八大樣”:

12、 eggs, cows milk, peanut, soybean, wheat, tree nuts, fish and crustacean蛋品、牛奶、花生、黃豆、小麥、樹木堅(jiān)果、魚類和甲殼類食品?！癝econd eight八小樣”: sesame seeds, sunflower seeds, cottonseed, poppy seed, fruits, beans other than green beans, peas and lentils.芝麻籽、葵花子、棉籽、罌粟籽、水果、豆類（不包括綠豆）、豌豆和小扁豆Others其它: tartrazine, sulphites and

13、latex.KFI food allergen category list* KFI食品過敏源類別清單Celery 芹菜Eggs蛋類Cows milk牛奶Peanut 花生Soybean 大豆Sulphites 亞硫酸鹽Wheat 小麥Seeds 種子Seafood海鮮 Tree nuts樹木堅(jiān)果Cottonseed棉籽poppy seeds罌粟子sesame seeds芝麻籽sunflower seeds葵花子Crustacean甲殼類Fish魚類almond 杏仁brazil nut巴西木堅(jiān)果cashew 賈如樹堅(jiān)果chestnut 栗子hazelnut 榛子macadamia nut p

14、ine nuts 松子pistachio 阿月渾子的果實(shí)pecan美洲山核桃 walnut核桃*Some exemptions are included in the list - Example一些例外在-實(shí)例表中列出1.ELISA方法檢測(cè)過敏原 （澳大利亞ELISASYSTEMS)：1.原理： 第一步：加入樣品 第二步：加入酶標(biāo)記物 第三步:加入發(fā)色劑及反應(yīng)停止液加入樣品后，如果樣品中有過敏原（Allergy)，樣品中的過敏原(Allergy)將會(huì)與包被在微孔中的特異性抗體結(jié)合。孵育15分鐘后，洗去沒有結(jié)合的雜質(zhì)。加入酶標(biāo)記物后，酶標(biāo)記物會(huì)與過敏原殘留物結(jié)合形成“三明治”夾心體，孵育15分

15、鐘后，洗去沒有結(jié)合的沒標(biāo)記物。如果樣品中有過敏原，加入發(fā)色劑（TMB底物溶液）孵育10分鐘后與酶標(biāo)記物結(jié)合顯藍(lán)色，加入反應(yīng)停止液停止反應(yīng)，溶液顯黃色，酶標(biāo)儀讀數(shù)或用肉眼判讀顏色。1.ELISA方法檢測(cè)過敏原（澳大利亞ELISASYSTEMS)：2.檢測(cè)步驟：第一步：加入100ul的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品到相應(yīng)的微孔中，輕微混合10秒，孵育15分鐘。第二步：倒掉微孔中的液體。第三步：用洗板緩沖液洗板，重復(fù)5次。第四步：在吸水紙上拍打，直到微孔中沒有殘留液體。第五步：100ul酶標(biāo)記物（綠蓋）到每個(gè)微孔中， ，輕微混合10秒，孵育15分鐘。第六、七、八步：（同第二、三、四步）1.ELISA方法檢測(cè)過敏原（澳

16、大利亞ELISASYSTEMS)：第九步：加入100ul發(fā)色劑（TMB底物），輕微混合10秒，孵育15分鐘。第十步：加入100ul的反應(yīng)停止液，輕微混合10秒。第十一步：肉眼比色（定性檢測(cè)）或酶標(biāo)儀讀數(shù)（定量檢測(cè)）1.ELISA方法檢測(cè)過敏原（澳大利亞ELISASYSTEMS)：食品過敏原檢測(cè)（棉拭子法）-用于設(shè)備表面殘留的檢測(cè)第一步：選擇一個(gè)棉拭子。第二步：在棉拭子管上標(biāo)記樣品號(hào)。第三步：放置棉拭子管在棉拭子管架上。第四步：打開棉拭子浸濕溶液管。第五步：將棉拭子插入浸濕溶液管浸濕棉拭子。第六步：轉(zhuǎn)移面拭子，如果棉拭子太濕，在棉拭子浸濕溶液管壁上輕微壓一下。1.ELISA方法檢測(cè)過敏原（澳大利

17、亞ELISASYSTEMS)：第七步：用浸濕的棉拭子交叉的平行線畫出陰影，或用自己的方式涂布要檢測(cè)的區(qū)域。第八步：放置棉拭子到對(duì)應(yīng)樣品的棉拭子管。第九步：封閉好棉拭子管。第十步：儲(chǔ)存棉拭子管，直到提取、分析。ELISA方法檢測(cè)過敏原（澳大利亞ELISASYSTEMS)：過敏原（ALLERGY）檢測(cè)產(chǎn)品表（ELISA）法）2. 熒光PCR方法檢測(cè)食品過敏原檢測(cè)原理： PCRFast是一種即用型的分子生物學(xué)方法，用于檢測(cè)食品、設(shè)備殘留樣品中的特異性DNA片段。檢測(cè)系統(tǒng)符合國(guó)際PCR標(biāo)準(zhǔn)（ISO）。該試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time PCR)的方法（含有FAM報(bào)告基因和非熒光淬滅基因的探針

18、）檢測(cè)食品及設(shè)備殘留中過敏原的特異性DNA片段。2.PCR方法檢測(cè)過敏原(德國(guó)IFP）6.樣品提?。―NA提取）： 每次PCR的分析，建議對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行兩次提取，并且每個(gè)運(yùn)行分析都設(shè)置提取對(duì)照(ISO 21571, 用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體的食品分析方法和用于衍生產(chǎn)品的核酸提取方法)。 對(duì)于不同的樣本，用以下優(yōu)化的CTAB方法可以得到好的結(jié)果。根據(jù)不同的樣本也可以采取不同的提取方法。 對(duì)于食品樣本，例如蔬菜和動(dòng)物脂肪或者卵磷脂，應(yīng)該采用正己烷萃取法提取。 a. 經(jīng)典的核酸提取方法（如CTAB方法） b. 試劑盒法提取樣品核酸 （用硅膠柱純化DNA，例如：PCRFast DNA純化。） 一次PCR設(shè)

19、置的每個(gè)分析系統(tǒng)都要進(jìn)行提取對(duì)照ETC分析，只加入試劑不加樣本。2.PCR方法檢測(cè)過敏原(德國(guó)IFP）6.3 DNA濃度的評(píng)估 總DNA的總量大于100ng不能進(jìn)行PCR反應(yīng)（用260nm的紫外進(jìn)行檢測(cè)，或者通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行估算因此，如果是含有高濃度DNA的樣本（大豆粉、玉米粉、香腸等樣本），DNA提取物必須用0.1 x TE 緩沖液進(jìn)行稀釋。 DNA提取物帶有抑制效應(yīng)（含有可可、巧克力的食品等）同樣需要用0.1 x TE 緩沖液進(jìn)行稀釋。例如：用步驟6.1(12)中100l的柱子或者步驟6.2中100l的洗脫柱子，已證明最佳稀釋比例如下：香腸樣本 1：401：80 玉米粉 1：20大豆粉

20、1：20 鳀魚片 純淀粉 純 巧克力 1：10和1：20動(dòng)物飼料 1：101：207. PCR設(shè)置 7.1 準(zhǔn)備 從錫箔袋中取出所需數(shù)量的反應(yīng)管，將其余的反應(yīng)管和干燥劑放回錫箔袋子，密封好，貯存于2 - 8 C。準(zhǔn)備所需量的MasterMix（每個(gè)反應(yīng)管12.5 l）。2.PCR方法檢測(cè)過敏原(德國(guó)IFP）7. PCR設(shè)置按下列表格所示吸取相應(yīng)的量加入反應(yīng)管：應(yīng)當(dāng)包括核酸提取對(duì)照、PCR陰性對(duì)照和陽性對(duì)照、試劑空白對(duì)照。reaction vialMaster- Mixextract sampleextract extraction controlwater deionizedfor each sample extractionsamplecolourless12.5 l12.5 l-per each analysis runpositive control PTCred12.5 l-12.5 lnegative control NTCcolourless12.5 l-12.5 lextraction control ETCcolourless12.5 l-12.5 l-2.PCR方法檢測(cè)過敏原(德國(guó)IFP）8. 評(píng)估：8.1實(shí)時(shí)評(píng)估樣本：下表顯示了評(píng)估。陽性反應(yīng)應(yīng)該給出一個(gè)最后的熒光值，這個(gè)值明顯高于閾值。SampleInternal amplification control