生物技術(shù)藥物的生物學(xué)活性測定

1、生物技術(shù)藥物的生物學(xué)活性測定生物技術(shù)藥物1、生物技術(shù)：基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程2、生物技術(shù)藥物：細(xì)胞因子、抗體、疫苗、寡核苷酸藥物、基因治療藥物等3、臨床應(yīng)用：預(yù)防、治療、診斷腫瘤、心血管疾病、遺傳病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染病、哮喘、傷口愈合等生物技術(shù)藥物的特點1生物技術(shù)藥物與化學(xué)藥物性質(zhì)不同化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)、多肽、核酸等蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)示意圖生物技術(shù)藥物的特點2活性由產(chǎn)品的高級結(jié)構(gòu)決定質(zhì)量數(shù)不能反映產(chǎn)品的藥效學(xué)和生物學(xué)活性3影響活性因素：表達(dá)體系大腸桿菌、酵母、哺乳動物，是否糖基化純化方案尤其是包含體變性、復(fù)性過程凍干工藝生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求保證藥物的安全性、有效性和質(zhì)量可控；活

2、性（效力）的測定是保障產(chǎn)品有效性的最重要指標(biāo)之一，是考察產(chǎn)品全面特征的重要步驟：重組細(xì)胞因子生物學(xué)活性（效價）測定在原液和成品檢定中，生物學(xué)活性測定都是重要指標(biāo)；生物學(xué)活性測定體內(nèi)和體外均可以進(jìn)行；獲得的結(jié)果在一定程度上依賴于采用的方法；幾乎所有的生物活性測定都是比較分析實驗，需要標(biāo)準(zhǔn)品或參考品；不一定直接反映產(chǎn)品的臨床適應(yīng)癥，但要能夠準(zhǔn)確測定產(chǎn)品效價、評價產(chǎn)品穩(wěn)定性與批間一致性生物學(xué)活性測定的幾種主要方法體內(nèi)測定法整體測定，利用動物體內(nèi)某些指標(biāo)的變化；離體動物器官測定法生化酶促反應(yīng)測定法不依賴于活的生物系統(tǒng)，主要基于產(chǎn)品與某種物質(zhì)的結(jié)合或產(chǎn)品本身的化學(xué)反應(yīng)生物學(xué)活性測定的幾種主要方法4免疫學(xué)

3、活性測定法利用蛋白對異種動物有相應(yīng)的免疫原性，制備抗體，然后通過ELISA測定含量。5體外細(xì)胞培養(yǎng)測定法促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞生長、間接保護(hù)細(xì)胞作用體外細(xì)胞培養(yǎng)測定法1、促進(jìn)細(xì)胞增殖a)促進(jìn)某種細(xì)胞的生長，但不依賴3T3細(xì)胞/EGF、bFGFb)是某種細(xì)胞生長的依賴因子TF-1/GM-CSF、NFS-60/G-CSF、CTLL-2/IL-22、3、抑制細(xì)胞增殖間接保護(hù)細(xì)胞作用L929/TNFIFN/WISH-VSV測定方法的選擇傳代細(xì)胞(因子依賴細(xì)胞非因子依賴細(xì)胞)原代細(xì)胞離體器官體內(nèi)測定法定量方法半定量方法定性方法生物學(xué)活性和比活性生物學(xué)活性每ml或每支待測樣品中含有的生物學(xué)活性單位，U或I

4、U或AU/ml（支）比活性主要針對原液或原料藥每單位質(zhì)量（mg）蛋白質(zhì)中含有的特定生物學(xué)活性單位，U/mg或IU/mg或AU/mg比活性（UorIU/mg）=不同測定方法的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)不同：1、80-150%如IFN、GM-CSF、G-CSF等細(xì)胞因子依賴、抑制細(xì)胞生長或直接殺死細(xì)胞2、70-200%如EGF、bFGF等劑量-反應(yīng)曲線不特別陡峭標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）的作用1、所用試劑或培養(yǎng)基的配制、純度、靈敏度不同；2、細(xì)胞系代次或來源不同；3、試驗動物的品系和健康狀況；4、不同實驗室、不同試驗人員、不同試驗時間統(tǒng)一尺度、最大限度地消除誤差，從而獲得一致的結(jié)果；生物學(xué)活性測定需要的條件（以細(xì)胞為基礎(chǔ)的活

5、性測定）1、細(xì)胞培養(yǎng)所需要的全部條件2、活性測定用標(biāo)準(zhǔn)品或參考品3、酶標(biāo)儀及軟件分析系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念1、細(xì)胞系和細(xì)胞株2、傳代細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。3、原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式1）貼壁生長2）懸浮生長3T3，MCF-7，WISHHL-60，7TD1，TF-1，NFS-60細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長的條件1、無污染環(huán)境2、細(xì)胞生存環(huán)境iaia溫度：37C,39C很快死亡iaia氣體環(huán)境和氫離子濃度：o2jajaco：5%或10%CO+HO-HCO-H+HCO3-22223jajapH：7.2

6、-7.4ia,a滲透壓3、培養(yǎng)基常用合成培養(yǎng)基1、MEM(minimumessentialmedium)2、DMEM(DulbeccomodifiedEaglemedium):高糖和低糖之分(1000和4500mg/L的葡萄糖)3、RPMI16404、199、F12、SF12等配制時要注意：水、碳酸氫鈉、pH值、滲透壓、L-谷胺酰胺血清和抗生素1、血清：牛血清（FBS,fetalbovineserum;FCS不準(zhǔn)確）、馬血清（HS）無支原體，無菌，需經(jīng)促增殖試驗驗證5-20%2抗生素：雙抗（青霉素+鏈霉素）、慶大霉素消化液1、胰蛋白酶溶液：0.25%或0.125%Lys-Arg、粘蛋白和糖蛋白

7、、細(xì)胞骨架2、EDTA溶液：0.53mM3、0.25%（w/v）Trypsin-0.53mMEDTA細(xì)胞計數(shù)血細(xì)胞計數(shù)器：（A+B+C+D）/4X104X稀釋倍數(shù)=細(xì)胞數(shù)/ml中國藥典三部收錄的重組產(chǎn)品的生物學(xué)活性測定體系干擾素概述1、最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因具有干擾病毒復(fù)制的作用而得名；2、IFN包括IFNalb,a2b,a2a,0，y，w3、IFN生物學(xué)活性測定方法：用細(xì)胞株檢測、用基因工程技術(shù)檢測、細(xì)胞病變抑制法（即CPE法，為國際標(biāo)準(zhǔn)IFN測定法）實驗原理IFN能刺激某些指示細(xì)胞（如Wish、Hep-2及人胚肌皮或肺單層細(xì)胞）產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細(xì)胞免受VSV病毒的攻擊。用結(jié)晶紫對活細(xì)

8、胞進(jìn)行染色,通過光吸收值計算活細(xì)胞數(shù)，然后根據(jù)待測樣品不同稀釋度的保護(hù)能力，計算干擾素生物學(xué)活性。結(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫為一種堿性染料，可以使細(xì)胞膜染色，染色后洗去結(jié)晶紫染液可以測定光吸收值，光吸收值與染色細(xì)胞數(shù)成正比；該染色方法簡單易行，適合貼壁細(xì)胞的量反應(yīng)測定；不同國家采用不同的活性測定細(xì)胞：WISH細(xì)胞-VSV病毒；WISH細(xì)胞IFN生物學(xué)活性測定曲線MTT比色法原理_MTT:四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide)活細(xì)胞的線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可代謝MTT等四唑鹽類物質(zhì)(如XTT、WST-1

9、)，還原為紫色的結(jié)晶狀的物質(zhì)formazen,沉積在細(xì)胞周圍，用DMSO溶解后，通過酶標(biāo)儀讀取光吸收值，檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)。一般情況下，formazen的量與活細(xì)胞數(shù)相一致，因此吸光度值的大小間接反映存活的細(xì)胞數(shù)量。EGF概述1、20世紀(jì)60年代從小鼠頜下腺中提取出的小分子蛋白；2、人和鼠的EGF都只有53個氨基酸，無糖基化位點，3對二硫鍵，無a-helix；3、臨床用途:燒傷、燙傷、角膜損傷、糖尿病引起的腳趾潰瘍等BALB/C3T3細(xì)胞GM-CSF的概述一GM-CSF是分子量為22kD的糖蛋白，含127個氨基酸殘基。由于可以刺激造血干細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成細(xì)胞集落而命名。一可以作用于造血干細(xì)

10、胞，促進(jìn)其分化增殖，如單核巨噬細(xì)胞增殖，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。還能刺激多能干細(xì)胞和早期紅細(xì)胞的增殖和分化。GM-CSF的概述臨床應(yīng)用：A預(yù)防和治療腫瘤放療或化療后引起的白細(xì)胞減少癥。治療骨髓造血機能障礙及骨髓增生異常綜合征。預(yù)防白細(xì)胞減少可能潛在的感染并發(fā)癥。使感染引起的中性粒細(xì)胞減少的恢復(fù)加快。TF-1細(xì)胞GM-CSF生物學(xué)活性曲線用EXCEL作圖結(jié)果實驗結(jié)果的計算數(shù)據(jù)用SOFTMAX軟件分析四參數(shù)方程式：y=(A-D)/(1+(X/C)P)+D對各實驗樣品的光吸收值、預(yù)稀釋倍數(shù)、樣本梯度等數(shù)據(jù)采用計算機程序或EXCEL進(jìn)行處理。分別計算各實驗樣品的半效稀釋倍數(shù)，即從樣本溶液至相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品50最大效應(yīng)點的稀釋倍數(shù)，并按下式計算實驗結(jié)果：實驗結(jié)果的計算待檢樣品效價=標(biāo)準(zhǔn)品效價X待檢樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)X待檢樣品半效稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)實驗結(jié)果的計算如果曲線發(fā)生了平移或平行性關(guān)系不好：