ILKmRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其穩(wěn)定表達(dá)的RNA干擾載體構(gòu)建

1、ILKmRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其不變表達(dá)的RNA滋擾載體構(gòu)建【摘要】目的檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞株中ILK的RNA程度，并構(gòu)建針對(duì)ILK基因的特異性RNA滋擾(RNAi)表達(dá)載體。要領(lǐng)通過RT-PR檢測(cè)ILK基因在三種結(jié)腸癌細(xì)胞株S480、L-V及HT29RNA的表達(dá)；根據(jù)GenBank提供的ILK基因RNA序列，方案具有小發(fā)夾布局的兩條DNA序列，化學(xué)合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA片斷，毗連到經(jīng)HindBgl酶切線性化的pSUPER-ne-EGFPH1pSNE/H1質(zhì)粒上，形成重組載體pSNE-ILK，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒經(jīng)Hind/ER雙酶切斷定和測(cè)序斷定，不變轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HT29。結(jié)

2、果RT-PR檢測(cè)，ILK基因在三種結(jié)腸癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，ILK/-atin電泳條帶強(qiáng)度比：S480為0.63，HT29為0.65，L-V為0.33。樂成構(gòu)建了針對(duì)ILK基因的特異性RNA滋擾載體pSNE-ILK和比較的無關(guān)基因載體pSNE-ntrl，并不變轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29。結(jié)論樂成構(gòu)建了針對(duì)ILK基因的特異性RNAi載體，并不變轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，能有用按捺ILK基因，為下一步探究ILK基因在結(jié)腸癌歷程中的作用和結(jié)腸癌的基因治療奠基了基矗【關(guān)鍵詞】RNA滋擾載體構(gòu)建RT-PR整合素毗連激酶ExpressinfILKRNAinlnarinaellLinesandnstrutinfILK

3、-RNAiStableExpressingVetrKeyrds：RNAinterferene；vetrnstrutin；RT-PR；integrin-linkedkinase免疫染色強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞的浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移以及腫瘤的分級(jí)、分期呈正相干7。RNA滋擾RNAinterferene，RNAi8是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默沉靜征象，它是通過落解具有同源序列靶基因的RNA，到達(dá)制止基因表達(dá)的作用，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的歷程，具有高特異性、高不變性、高服從性、高穿透性、能同時(shí)按捺多個(gè)基因等特性9。RNAi是基因沉默沉靜的抱負(fù)東西，可以直接用于疾病相

4、干基因的按捺，從而到達(dá)疾病治療或防范的目的。本實(shí)行是通過RT-PR技能，檢測(cè)ILKRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)環(huán)境，并構(gòu)建其特異性的RNA滋擾載體，按捺ILK基因表達(dá)，為結(jié)腸癌基因治療提供了理論根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)11細(xì)胞株、質(zhì)粒及菌株結(jié)腸癌細(xì)胞株S480、HT29、L-V細(xì)胞為本實(shí)行室保存。含EGFP的pSUPER-nesiRNA表達(dá)載體pSNE由本校戚華兵博士、何建明博士惠贈(zèng)；大腸埃希菌DH5為本實(shí)行室保存。12重要試劑限定性內(nèi)切酶Hind、Bgl和ER為NeEnglandBilab公司產(chǎn)物；RT-PR試劑盒、T4DNA毗連酶、DL2000DNAarker及-HindDNAarker為TaKa

5、Ra公司產(chǎn)物；質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒和膠接納試劑盒為BiDev公司產(chǎn)物；H-DE造就基為Hylne公司產(chǎn)物；新生牛血清為民海公司產(chǎn)物；G418為ARES公司產(chǎn)物；TRIzl、Lipfetaine2000為Invitrgen公司產(chǎn)物。引物均由上海生工公司合成。13要領(lǐng)131結(jié)腸癌細(xì)胞總RNA的提取接納TRIzl法抽提總RNA詳細(xì)要領(lǐng)拜見Invitrgen公司的TRIzl說明書。132RT-PR133RNA滋擾載體的構(gòu)建根據(jù)報(bào)道ILKsiRNA序列10及已頒發(fā)的基因庫中ILK基因的RNA序列，利用軟件方案，根據(jù)ligengine提供的pSUPER-RNAiSyste中構(gòu)建發(fā)夾狀短鏈RNA的原那么

6、，53別離為Bgl酶切位點(diǎn)靶向公理鏈發(fā)夾狀布局靶向反義鏈停頓序列Hind酶切位點(diǎn)，方案為：sensEiLK為：5-GATTGTTGAGTTGTAGGTTAAGA-GATGAGAAGTAAGAGTTTTTA-3，antisenseILK為：5-AGTTAAAAATGTTGAGTTGT-AGGTTTTGAATGAGAAGTAAGAGGG-G-3。無關(guān)基因比較組sense-ntrl為：5-GATTGTTGAGTTGTAGGTTAAGAGA-TGAGAAGTAAGGATTTTTA-3，antisense-ntrl為：5-AGTTAAAAATGTTGAGTTGT-AGGTTTTGAATGAGAAGTAA

7、GAGGG-G-3。將合成的單鏈稀釋為3g/l，退火成雙鏈，于4保存。用Bgl及Hind雙酶切質(zhì)粒pSNE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30in，純化接納線性化質(zhì)粒pSNE根據(jù)BiDev膠接納試劑盒說明書舉行。T4DNA毗連酶毗連線性化質(zhì)粒pSNE和退火產(chǎn)物，以線性化質(zhì)粒pSNE和滅菌水毗連做陰性比較。4毗連留宿后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感覺態(tài)細(xì)胞感覺態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化參照?分子克隆指南?，在氨芐青霉素抗性的LB平板上37造就留宿挑選，隨機(jī)挑取菌落，擴(kuò)增造就后，抽提并純化質(zhì)粒，用ER及Hind雙酶切，1.0瓊脂糖凝膠電泳斷定陽性為281bp，陰性為227bp。酶切斷定準(zhǔn)確的進(jìn)一步測(cè)序斷定。134RNA滋擾載

8、體細(xì)胞轉(zhuǎn)染應(yīng)用Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29。轉(zhuǎn)染前一天，用0.25胰酶溶液消化對(duì)數(shù)生恒久的HT-29細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種到24孔板中，接種密度約莫為1.5105/孔，每孔參加500l含20%小牛血清的H-DE造就液。轉(zhuǎn)染步調(diào)詳見Invitrgen的Lipfetaine2000產(chǎn)物利用說明書。轉(zhuǎn)染48h后可在熒光顯微鏡下不雅察到綠色熒光。以1000g/l濃度的G418壓力挑選，以未轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞為陰性比較。得到不變表達(dá)的HT-29/pSNE-ILK細(xì)胞后，做RT-PR進(jìn)一步驗(yàn)證滋擾服從，滋擾服從1-滋擾組/比較組100%。135統(tǒng)計(jì)學(xué)要領(lǐng)各項(xiàng)計(jì)量資料均以xs表

9、現(xiàn)，應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)闡發(fā)軟件舉行數(shù)據(jù)闡發(fā)，接納t查驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21ILKRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)經(jīng)RT-PR擴(kuò)增，ILK基因擴(kuò)增片斷長度為406bp，-atin擴(kuò)增片斷長度為500bp，與實(shí)行方案切合。電泳結(jié)果直接用Bi-Rad凝膠拍照體系保存，用BandSan軟件舉行闡發(fā)，2條帶光密度比(ILK/-atin)為基因表達(dá)的相對(duì)值：S480細(xì)胞為0.63，HT29細(xì)胞為0.65，均高表達(dá)；L-V細(xì)胞為0.33，中度表達(dá)見圖1。22表達(dá)載體的構(gòu)建及斷定退火產(chǎn)物與線性化載體毗連后，轉(zhuǎn)化大腸菌DH5，平板上有數(shù)十個(gè)菌落生長，陰性比較無菌落生長，各隨機(jī)取4個(gè)菌落

10、，擴(kuò)大造就后，抽提質(zhì)粒，以Hind和ER雙酶切闡發(fā)雙酶切pSNE質(zhì)粒作為陰性比較。此中14號(hào)為pSNE-ILK質(zhì)粒，58號(hào)為pSNE-ntrl質(zhì)粒，910號(hào)為pSNE質(zhì)粒。2、3、4、5、7號(hào)質(zhì)粒能被切出281bp巨細(xì)的片斷，8、9、10號(hào)能被切出227bp巨細(xì)的片斷見圖2。送4、5號(hào)質(zhì)粒到上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明載體pSNE-ILK及比較載體pSNE-ntrl構(gòu)建樂成見圖3。23RNA滋擾載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡不雅察3討論對(duì)付中晚期結(jié)直腸癌患者，最重要的治療本領(lǐng)是化療，而化療結(jié)果卻不盡人意，基因治療成為如今研究較熱門的要領(lǐng)之一。RNA滋擾技能是通過落解具有同源序列靶基因的RNA，到達(dá)基因

11、敲除，進(jìn)而制止該基因表達(dá)的作用，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因表型缺失的歷程8，9。ILK是一種新近創(chuàng)造的絲/蘇氨酸卵白激酶8，到場多種信號(hào)傳導(dǎo)通路。很多研究證明ILK是調(diào)治體內(nèi)很多生物歷程如增殖、黏附、凋亡和轉(zhuǎn)移的樞紐點(diǎn)4，5。外洋研究表現(xiàn)，ILK的表達(dá)量與前線腺腫瘤、玄色素瘤、卵巢癌的形成嚴(yán)密相干，且表達(dá)量的凹凸與腫瘤細(xì)胞的惡性程度、浸潤和轉(zhuǎn)移本領(lǐng)呈正相干7，1114。如今已有研究表現(xiàn)，通過按捺ILK來按捺PKB的活性，可以或許導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞的步伐性殞命和G1S期細(xì)胞周期的停滯15，因此，我們推測(cè)，ILK大概成為以后治療結(jié)腸癌的一個(gè)抱負(fù)靶點(diǎn)16。我們通過本實(shí)行證明，在差異結(jié)腸癌細(xì)胞系中，ILKRNA

12、均有表達(dá)，而且表達(dá)強(qiáng)度均在中度以上，這與外洋相干報(bào)道同等4，5。而正常結(jié)腸內(nèi)膜中，ILK無表達(dá)或表達(dá)極其薄弱，無法測(cè)出4，5，17。因此我們推測(cè)ILK在結(jié)腸癌的形成和轉(zhuǎn)移中大概起著非常緊張的作用，而如今阻斷ILK基因的抗體大概藥物非常稀疏，而且非常昂貴，因此我們構(gòu)建針對(duì)ILK基因的特異性RNA滋擾載體，阻斷ILK基因的表達(dá)，以到達(dá)基因沉默沉靜的結(jié)果，為研究ILK基因在結(jié)腸癌的作用開發(fā)了新的途徑。本實(shí)行中，我們樂成構(gòu)建了針對(duì)ILK基因的RNAi載體pSNE-ILK，并不變轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，經(jīng)G418壓力挑選，得到不變表達(dá)細(xì)胞系HT29/pSNE-ILK。經(jīng)RT-PR證明，pSNE-ILK對(duì)ILK

13、基因有明顯的滋擾作用，可以滿意實(shí)行要求。這為下一步探究ILK基因在結(jié)腸癌的基因研究及治療中的作用提供了新思緒?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1HanniganGE,LeungHagestEijn,FitzGibbnL,etal.Regulatinfelladhesinandanhrage-dependentgrthbyanebeta1-integrin-linkedprteinkinaseJ.Nature,1996,379(6560):91-96.2u,DedharS.Integrin-linkedkinase(ILK)anditsinteratrs:aneparadigfruplingfextraellula

14、ratrixtatinytskeletnandsignallingplexesJ.JellBil,2001,155(4):505-510.3DedharS,illiasB,HanniganG.Integrin-linkedkinase(ILK):aregulatrfintegrinandgrth-fatrsignallingJ.TrendsellBil,1999,98:319-323.4PersadS,DedharS.Therlefintegrin-linkedkinase(ILK)inanerprgressinJ.aneretastRev,2022,224:375-384.5Hannigan

15、G,TrussardAA,DedharS.Integrin-linkedkinase:aanertherapeutitargetuniqueangitsILKJ.NatRevaner,2022,51:51-63.6HuangY,u.Integrin-linkedkinaseandassiatedprteins(revie)J.IntJled,1999,3(6):563.7BravuV，KlirnsG,PapadakiE,etal.Integrin-linkedkinase(ILK)expressininhuanlnanerJ.BrJaner,2022,8912:2340-2341.8FireA

16、,XuS,ntgeryK,etal.Ptentandspeifigenetiinterferenebyduble-strandedRNAinaenrhabditselegansJ.Nature,1998,3916669:806-811.9劉峰,王麗,王培林RNA滋擾臨床應(yīng)用的研究希望J外洋醫(yī)學(xué)遺傳分冊(cè),2022,27(1)：11-l510DuxburyS,ItH,BenitE,etal.RNAInterferenedenstratesaNvelrlefrintegrin-linkedkinaseasadeterinantfpanreatiadenarinaellgeitabineheresis

17、taneJ.linanerRes,2022,11(9)：3433-3438.11GraffJR,DeddensJA,KniekB,etal.Integrin-linkedkinaseexpressininreasesithinreasesithprstateturgradeJ.linanerRes,2001,7(7):1987-1991.12arttaA,ParharK,enD,etal.haraterisatinfintegrin-linkedkinasesignallinginspradihuanlnanerJ.BrJaner,2022,88(11):1755-1762.13DaiDL,a

18、kretsvN,apsEI,etal.Inreasedexpressinfintegrin-linkedkinaseisrrelatedithelanaprgressinandprpatientsurvivalJ.linanerRes,2022,9(12):4409-4414.14AhedN,Riley,livaK,etal.Integrin-linkedkinaseexpressininreasesithvariantuurgradeandissustainedbyperitnealtuurfluidJ.Pathl,2022,201(2):229-237.15PersadS,AnellS,GrayV,etal.Inhibitinfintgrin-linkedkinase(ILK)suppressesativatinfprteinkinaseR/AktandinduesellylearrestandapptsisfPTEN2utantprstateanerellsJ.PratlAadSiUSA,20