應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達以增強SGC7901胃癌細胞對順鉑

1、應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達以增強SGC7901胃癌細胞對順鉑【摘要】目的利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)survivin基因的表達，檢測SG7901胃癌細胞轉(zhuǎn)染前后對順鉑敏感性的變化。方法實驗分為空白對照組(ntrl組)、單用順鉑組(DDP組)、脂質(zhì)體組(Lip組)、單用survivinsiRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivinsiRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivinsiRNA結(jié)合順鉑作用組(結(jié)合作用組)。人工合成survivinsiRNA，通過Lip包裹將siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞SG7901，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。TT法檢測各組細胞的增殖抑制率，e

2、sternblt及免疫細胞化學法檢測survivin蛋白的表達，Hehst染色觀察細胞凋亡的形態(tài)改變。結(jié)果Hehst染色熒光顯微鏡下ntrl組、Lip組及siRNA組細胞核呈正常的藍色,而DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組細胞核染色增強、核質(zhì)濃縮、核碎裂,呈凋亡改變;結(jié)合作用組細胞增殖抑制率(63.934.22)%明顯高于其余各組(P0.05);轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組survivin蛋白表達明顯低于其他各組(P0.05)。結(jié)論應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)SG7901胃癌細胞中survivin基因的表達，可以增加其對順鉑的藥物敏感性?！娟P(guān)鍵詞】survivin;siRNA;胃癌;順鉑Abstrat:bjetiv

3、eTdetetthevariatinsinisplatinsensitivityfhuangastriarinaelllineSG7901befreandaftertransfetintspeifiallydnregulatetheexpressinfsurvivinggeneithsallinterferingRNA(siRNA)tehnlgy.ethdsThisexperientisdividedintthentrlgrup,isplatingrup(DDPgrup),lipsegrup(lipgrup),siRNAgrup,transfetingrupandsiRNAbinedDDPgr

4、up(binedgrup).SurvivinsiRNAasartifiiallysynthesizedandthentransfetedintgastrianerellsithlipse.Thetransfetineffetseredeterinedbyflureseneirspy.TheinhibitryratefellprliferatinasassayedbyTT,andtheexpressinfsurvivinprtEinasdeterinedbyesternbltandiunytheialstaining.Therphlgialhangesftheappttiellserebserv

5、edbyHehststaining.ResultsAsbservedundertheflureseneirspeafterHehststaining,thenulEIpresentedasnralblueinthentrlgrup,lipgrupandsiRNAgrup,hileDDPgrup,siRNAtransfetingrupandsiRNAbinedisplatingruphadsuhhangesasreinfrednulearstaining,karypyknsisandkaryrrhexisithappttihanges.Theinhibitinratefellprliferati

6、ninsiRNAbinedisplatingrup(63.934.22)%asarkedlyhigherthanthethergrups(P0.05).parediththergrups,theexpressinfsurvivinprteininthetransfetingrupandsiRNAbinedisplatingrupassignifiantlyredued,andthediffereneshadstatistialsignifiane(P0.05).nlusinTheappliatinfsiRNAtehnlgytdnregulatethesurvivingeneexpressinf

7、huangastriarinaelllineSG7901isabletenhaneitsdrugsensitivitytisplatin.Keyrds：survivin;siRNA;gastriarina;isplatin順鉑是目前臨床上最常用的化療藥物之一,其抗腫瘤作用明顯、價格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療,但是長期應(yīng)用后極易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，降低其療效,并且隨著劑量的增加，出現(xiàn)的副作用越來越多。有研究說明,長期應(yīng)用順鉑后，某些腫瘤細胞中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象并且可檢測到存活素(survivin)的高表達1。survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，具有強大的抗凋亡功能，屬于凋亡抑制因子(inh

8、ibitrfapptsisprteins，IAP)家族成員之一。survivin與胃癌的定量研究說明，其表達量與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。分化程度越低的胃癌組織中survivin表達率越高，患者預(yù)后越差2。因此，本實驗通過將人工合成的survivin小干擾RNA(siRNA)經(jīng)脂質(zhì)體(lipse,Lip)包裹后轉(zhuǎn)染胃癌細胞SG7901，討論特異性地降低胃癌細胞SG7901中survivin的表達能否增強該細胞對順鉑的化療敏感性，從而為胃癌的化療開拓一條新途徑。1材料和方法1.1材料1.1.1主要試劑RPI1640購自美國GIB公司;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品;LipfetaineT200

9、0試劑盒及PTIEN轉(zhuǎn)染液為Invitrgen公司產(chǎn)品，兔抗人survivin多克隆抗體購于Santaruz公司，四甲基偶氮唑藍(TT)購自Siga公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)公司，稀釋于RPI1640培養(yǎng)液中，終濃度為1g/L。1.1.2細胞株人胃癌細胞株SG7901，由徐州醫(yī)學院病理學教研室保存。1.2方法1.2.1實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染實驗分為空白對照組(ntrl組)、單用順鉑組(DDP組)、Lip組、單用survivinsiRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivinsiRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivinsiRNA結(jié)合順鉑作用組(結(jié)合作用組)，每組設(shè)4個復(fù)孔。各組作用SG7901細胞7

10、2h后進展相應(yīng)后續(xù)試驗。人胃癌細胞SG7901常規(guī)培養(yǎng)至細胞交融約40%70%時進展轉(zhuǎn)染。用ptie分別稀釋脂質(zhì)體和survivinsiRNA至試驗所需濃度并輕輕混勻，5in后將survivinsiRNA稀釋液與Lip稀釋液混勻，并在室溫下放置30in使之充分結(jié)合，參加細胞中，輕輕搖擺。375%2溫箱中培養(yǎng)，46h后吸出，參加含10%FBS的RPI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后即可用于后續(xù)試驗。1.2.2TT法檢測細胞增殖抑制率實驗分組同前，各組設(shè)4個復(fù)孔，分別搜集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細胞，按每孔1104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后，根據(jù)分組參加所需試劑及藥物。72h后，每孔參加20l的TT

11、，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加150l的二甲基亞砜(DS)室溫振蕩10in后570n波長處測定光密度值(D570)。細胞抑制率(%)=(1-D570處理組/D570對照組)100%。1.2.3免疫細胞化學檢測survivin蛋白的表達棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)SP9001試劑盒說明書進展操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。survivin以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。1.2.4esternblt法檢測survivin蛋白的表達搜集各組細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，參加細胞裂解液，冰浴30in進展充分裂解。4低溫離心機13000r/in離心5in，取上清，F(xiàn)rlin酚法測

12、蛋白濃度。100g/孔上樣，進展12.5%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%的積層膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別參加一抗兔抗人survivin及-atin多克隆抗體，4孵育過夜，堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG孵育2h，四唑硝基藍(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BIP)顯色。一抗及二抗?jié)舛染鶠?1000，用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，并用IageJ圖像分析軟件分析。以-atin為內(nèi)參，表示survivin蛋白的相對表達強度。1.2.5Hehst33258檢測細胞凋亡形態(tài)Hehst33258染色：棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)說明書進展染色。熒光顯微鏡下觀察

13、拍照。1.3統(tǒng)計學處理用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進展統(tǒng)計學分析，計量資料采用s表示，多個樣本均數(shù)比擬采用方差分析，兩兩比擬用q檢驗，相關(guān)性檢驗用Pearsn相關(guān)分析。P0.05認為差異有顯著性。2結(jié)果2.1熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)轉(zhuǎn)染6h后，出現(xiàn)綠色熒光，細胞碎片增多。見圖1。2.2轉(zhuǎn)染survivinsiRNA后胃癌細胞SG7901對順鉑敏感性的影響TT法檢測發(fā)現(xiàn)DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組對SG7901細胞的增殖有較明顯的抑制作用。其中結(jié)合作用組的細胞增殖抑制率最高，與其余各組相比差異有顯著性(P0.05)。見表1。圖1綠色熒光蛋白FIT標記siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.SG790

14、1細胞(400)2.3轉(zhuǎn)染前后細胞中survivin蛋白表達程度的改變2.3.1免疫細胞化學檢測結(jié)果與ntrl組、lip組、siRNA組和DDP組相比,轉(zhuǎn)染后細胞中survivin蛋白表達明顯降低(P0.05)。見圖2、表2。表1SurvivinsiRNA對SG7901細胞增殖的抑制作用表2各組SG7901細胞survivin蛋白的表達與其余各組比擬：#、*P0.05;與DDP組比擬：P0.052.3.2esternblt法檢測結(jié)果轉(zhuǎn)染組survivin蛋白的表達明顯低于其余各組(P0.05);DDP組作用細胞72h后，survivin蛋白的表達明顯高于其余各組(P0.05)。見表3。2.4轉(zhuǎn)

15、染前后對細胞凋亡的影響Hnhest33258染色顯示ntrl組、Lip組和siRNA組細胞的細胞核完好，呈正常的藍色;DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組細胞的細胞核染色增強、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變。表3各組SG7901細胞中survivin蛋白的D值與其余各組比擬：#P0.05;與DDP組比擬：*P0.053討論胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,世界胃癌發(fā)病率為13.86/10萬,僅次于肺癌居惡性腫瘤的第2位。在我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤之首,每年死于胃癌者達16萬人,占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23%。由于胃癌早期診斷率較低，而進展期胃癌單純根治手術(shù)年生存率僅40%，即使擴大切除范圍的超根治

16、術(shù)也未明顯進步生存率，因此，目前臨床上化療對于胃癌的治療具有重要意義。順鉑由于其抗腫瘤作用明顯、價格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療，是目前臨床最常用的化療藥物之一，在腫瘤的治療中占有重要地位。但是長期運用順鉑會造成機體對其敏感性降低，從而嚴重影響了化療效果，并且降低了患者的生存率。survivin直接作用于aspase，主要通過抑制凋亡終末效應(yīng)器aspase-3和aspase-7或干擾aspase-9的活性，阻斷細胞凋亡的共同通路。而順鉑也是通過aspase-3依賴的信號傳導途徑，誘導腫瘤細胞的凋亡而抑制腫瘤細胞的生長，從而到達抗腫瘤的效果3。并且有研究顯示，在耐順鉑的人胃癌細胞中，surv

17、ivin表達明顯高于普通人的胃癌細胞4。因此，我們認為降低腫瘤細胞中survivin的表達可能可以增強腫瘤細胞對順鉑的藥物敏感性。本實驗采用RNA干擾(RNAinterferene，RNAi)技術(shù)特異性的降低survivin在SG7901中的表達。RNAi技術(shù)是利用雙鏈RNA(dsRNA)可以特異性地降解具有同源序列的RNA，特異性地阻斷相應(yīng)基因的表達，從而成為近年來較為熱門的一種研究基因功能和進展基因治療的新方法5。RNAi在胞質(zhì)dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(Dier)的作用下裂解成為具有2123nt堿基的短片段dsRNA分子，稱之為siRNA，siRNA與核酶復(fù)合體結(jié)合形成RNA誘導的沉默復(fù)

18、合物(RIS),RIS通過堿基配對方式與同源靶向RNA結(jié)合后，從siRNA的3端將靶RNA切割成小于12nt的片段并使其降解，從而阻斷相應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制6。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，RNAi技術(shù)具有特異、高效和毒性小的特點，有著明顯的優(yōu)勢。本研究采用脂質(zhì)體包裹survivinsiRNA轉(zhuǎn)染SG7901細胞6h后，熒光顯微鏡下可以看見綠色熒光，出現(xiàn)細胞碎片，并且轉(zhuǎn)染后的細胞survivin蛋白的表達明顯降低。結(jié)合作用組Hnhest染色可見SG7901細胞核染色增強、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變的細胞明顯多于DDP組。而轉(zhuǎn)染后順鉑對SG7901的細胞增殖抑制率從轉(zhuǎn)染前的(42.972.73)%進步到(63.934.22)%。本實驗結(jié)果顯示，通過RNAi技術(shù)特異性地下調(diào)胃癌SG7901細胞中survivin的表達，可以明顯增加SG7901對順鉑的敏感性，增強順鉑對細胞的殺傷作用，從而為臨床治療胃癌提供了一個新的思路?！緟⒖嘉墨I】1ZaffarniN,DaidneG.Survivinexpressinandresistanetantianertreatent:perspetivesfrnetherapeutiinterventinsJ.Dru