結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)方法

1、結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)方法【摘要】在應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療結(jié)核病時(shí)，最為臨床醫(yī)師所關(guān)注的是細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥性。因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌對(duì)治療藥物不可防止的產(chǎn)生耐藥性，而影響肺結(jié)核病的治療效果。以致成難治型肺結(jié)核。【關(guān)鍵詞】抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)為使抗結(jié)核藥物對(duì)肺結(jié)核病的治療獲得預(yù)期效果，在應(yīng)用藥物治療之先，需要理解幾個(gè)問題：一、試管內(nèi)的抑菌濃度把抗結(jié)核藥物參加培養(yǎng)基內(nèi)，接種細(xì)菌以觀察藥物在多少濃度下可以抑制細(xì)菌生長，求出最小的抑菌藥物濃度(i)，i是臨床確定治療藥物劑量的根據(jù)。有關(guān)抗結(jié)核藥物的i，請(qǐng)見短程化療的細(xì)菌學(xué)基矗應(yīng)用不同培養(yǎng)基所測(cè)得的抑菌濃度有差異。如在改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基測(cè)得的抑菌濃度比液體培養(yǎng)基或半流

2、體培養(yǎng)基測(cè)得的抑菌濃度偏高。細(xì)菌在發(fā)育生長旺盛期對(duì)藥物敏感，當(dāng)細(xì)菌處于發(fā)育生長靜止?fàn)顟B(tài)以致處于休眠期那么藥物不呈現(xiàn)抑菌效果。根據(jù)細(xì)菌發(fā)育生長的興衰階段，構(gòu)成肺結(jié)核病治療的基矗二、血液內(nèi)的藥物濃度血液內(nèi)抗結(jié)核藥物濃度測(cè)定是研究藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收與排泄，療效與毒性的關(guān)系，體液內(nèi)藥物含量、分布、對(duì)細(xì)菌的有效抑菌濃度等?？纱_定藥物有效治療劑量與用藥次數(shù)等。由于結(jié)核病類型和發(fā)病部位不同，病變性質(zhì)不同，有的藥物吸收比擬快、有的藥物吸收比擬慢。有的體液內(nèi)含藥物濃度比擬高，有的體液內(nèi)含藥物濃度比擬低。即使在一樣的藥物治療條件下，各器官、組織內(nèi)的含藥物濃度不盡一樣，其間的差異是比擬大的。因此，血液內(nèi)藥物濃度的測(cè)

3、定，在抗結(jié)核藥物治療前和治療中均應(yīng)進(jìn)展藥物濃度測(cè)定，以理解個(gè)體的藥物代謝規(guī)律。對(duì)某些病例而言，可以起到抗結(jié)核藥物治療效果的監(jiān)控作用。一般規(guī)律。肌內(nèi)注射法給藥吸收比擬快、口服法給藥吸收比擬慢。肌內(nèi)注射法后3060in，口服法后12h，血液內(nèi)藥物濃度即出現(xiàn)頂峰曲線。內(nèi)科研究室用生物學(xué)方法，觀察鏈霉素肌注后，藥物在體內(nèi)的吸收，排泄的規(guī)律性，提供的技術(shù)資料為肺結(jié)核病的治療確定用藥劑量和給藥次數(shù)等以供參考?？诜Ｆ?50g后，按規(guī)定時(shí)間采集血液、尿液和痰液標(biāo)本，用生物學(xué)方法測(cè)定藥物在體液內(nèi)的分布和排泄情況，利福平的吸收和代謝進(jìn)程。測(cè)定結(jié)果說明：口服利福平450g后、3h血清內(nèi)到達(dá)對(duì)脊椎結(jié)核病人應(yīng)用異煙

4、肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等藥物的代謝進(jìn)展觀察。膿液內(nèi)的藥物濃度頂峰曲線出現(xiàn)的時(shí)間不同，有的病人膿液內(nèi)藥物頂峰曲線出如今4h,而有的病人出如今8h，說明個(gè)體和病變部位，以及病變性質(zhì)等不同而出現(xiàn)藥物濃度的差異?；瘜W(xué)測(cè)定法：此方法獲得的結(jié)果雖然比擬準(zhǔn)確，但是，需要比擬精細(xì)的儀器設(shè)備，如分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)等。此外，化學(xué)測(cè)定法需要標(biāo)本數(shù)量較多，同一個(gè)化學(xué)測(cè)定法不能應(yīng)用于血液、尿液、痰液、腦脊髓液和胸腹水等體液標(biāo)本的檢測(cè)。必須是不同體液應(yīng)用各自的化學(xué)測(cè)定法。所以，臨床實(shí)驗(yàn)室多采用生物學(xué)測(cè)定法。生物學(xué)測(cè)定法：首先選取對(duì)抗結(jié)核藥物最敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株先選對(duì)普通細(xì)菌敏感者，用普通細(xì)

5、菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)展測(cè)定，對(duì)普通細(xì)菌不敏感的藥物，選用分枝桿菌進(jìn)展測(cè)定。選妥標(biāo)準(zhǔn)菌株后，測(cè)得藥物濃度的抑菌圈(帶)直徑(高度)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線表。再測(cè)定待檢標(biāo)本的抑菌圈直徑。從標(biāo)準(zhǔn)藥物濃度曲線表求得待檢標(biāo)本內(nèi)的藥物含量。液相色譜測(cè)定法：液相色譜儀是比擬精細(xì)的昂貴的儀器，尚不能為臨床實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用。三、耐藥性測(cè)定方法多年來，許多方法提出用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定。目前有三種間接耐藥性測(cè)定方法應(yīng)用于臨床細(xì)菌學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)室。即絕對(duì)濃度法，耐藥比率法和耐藥比例法。長期以來國內(nèi)各臨床細(xì)菌檢查實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用絕對(duì)濃度法進(jìn)展結(jié)核分枝桿菌的耐藥性測(cè)定。1.絕對(duì)濃度法試驗(yàn)是按照抑制某一控制接種物生長的最低藥物濃度，耐藥性的斷定

6、是以某一特定藥物濃度的細(xì)菌生長超過某一確定的細(xì)菌菌落數(shù)(一般為20)而決定。藥物的“臨界濃度指抑制“野生型親代細(xì)菌生長程度，而對(duì)耐藥性變異株達(dá)不到如此高的抑菌濃度。耐藥“臨界濃度確實(shí)定需要各實(shí)驗(yàn)室對(duì)一定數(shù)量的“野生株測(cè)定后加以決定。并應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。各實(shí)驗(yàn)室的耐藥性試驗(yàn)結(jié)果才可進(jìn)展比擬。絕對(duì)濃度法耐藥性測(cè)定時(shí)，含藥培養(yǎng)基的制備，待測(cè)菌液的配制和接種時(shí)菌液的均勻性等都是測(cè)定法中的關(guān)鍵。培養(yǎng)基可以改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基或1小川培養(yǎng)基。所用藥品必須是純品，按出廠數(shù)價(jià)計(jì)算劑量，在有效期謨謾?br/所用藥物必須用分析天秤(1/1000)準(zhǔn)確稱量。對(duì)不溶于水的藥物如利福平類、乙(丙)硫異煙胺、氮苯硫脲等藥物稱量后先用適

7、量二甲基甲酰胺(或二甲基亞砜)完全溶解后，氟哌酸類藥物加適量1%氫氧化鈉液完全溶解后，再加水稀釋至需用量。利福平類藥物也可用無水乙醇或甲醇等試劑溶解。待測(cè)菌株菌液的制備：取別離培養(yǎng)后生長的菌株轉(zhuǎn)種在改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基生長旺盛的23周的菌落，用磨菌器仔細(xì)研磨成乳液樣菌液、滅菌水稀釋至1g/l的均勻菌液，備用。試管法：試管法是目前臨床細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定法。詳細(xì)操作法和步驟，見肺結(jié)核病診斷章，結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。微量法：微量法是70年代由川達(dá)村氏建立的結(jié)核分枝桿菌微型測(cè)定器檢測(cè)耐藥性法，又稱試劑盒測(cè)定法。直立擴(kuò)散法：直立擴(kuò)散法是用特制的直立擴(kuò)散試管進(jìn)展。試管高度與口徑同

8、中試管(18180)。在試管上部約1/5處有約45度的彎度，以阻止培養(yǎng)外溢，使試管內(nèi)培養(yǎng)基厚度保持一致。在試管側(cè)面自下向上標(biāo)有100的刻度，以便直接測(cè)出抑菌帶高度。2.比率法此種測(cè)定法和絕對(duì)濃度法用一樣培養(yǎng)基。制備一套平行的藥物敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基。需要配制多個(gè)含藥濃度的培養(yǎng)基。同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌(h37rv)和待測(cè)菌。以待測(cè)菌的最低抑菌濃度和標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度之比，接種菌量必需標(biāo)準(zhǔn)化。耐藥結(jié)果斷定：待測(cè)菌的耐藥比率8者為耐藥，耐藥比率2者為敏感、耐藥比率為4，按可疑或臨界斷定。比率法需要進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)菌株的對(duì)測(cè)定藥物的i測(cè)定，需要很好設(shè)計(jì)一套平行的藥物試驗(yàn)培養(yǎng)基。操作比擬繁多，不舉例試驗(yàn)說明。

9、3.耐藥比例法比例法是對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基、同時(shí)接種一樣體積的稀釋一定濃度的待測(cè)菌液。培養(yǎng)一定時(shí)間，在某一濃度的含藥培養(yǎng)獲得可計(jì)數(shù)菌落數(shù)和對(duì)照培養(yǎng)基獲得可計(jì)數(shù)菌落數(shù)相比，以百分率表示之。大于1者為耐藥。比例法耐藥性測(cè)定比例法和絕對(duì)濃度法一樣，均可采用直接耐藥性測(cè)定法和間接耐藥性測(cè)定法。直接耐藥性測(cè)定法是選擇涂片抗酸染色陽性痰標(biāo)本，經(jīng)稀釋后接種。由于痰標(biāo)本內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量難以掌握以及對(duì)細(xì)菌是活菌或死菌的情況不明，接種后的培養(yǎng)基常無細(xì)菌生長等因果關(guān)系，直接法現(xiàn)不為實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用。菌液濃度，選用接種改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基生長23周的旺盛菌落，配1g/l的菌液，以滅菌水稀釋至10-2、10-4的菌液，分別接種對(duì)照

10、培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基(各接種0.01l)。結(jié)果與報(bào)告：接種后，37孵箱培養(yǎng)4周報(bào)告耐藥性測(cè)定結(jié)果。假如對(duì)照培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)目在5個(gè)以下，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，含藥培養(yǎng)基未生長出可計(jì)數(shù)菌落，也應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)數(shù)對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基上生長菌落數(shù)，計(jì)算出耐藥菌的百分比。參考文獻(xiàn)1胡忠義，靳安佳，陳慧萍，等.噬菌體生物擴(kuò)增法快速測(cè)定結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性j.中華結(jié)核和呼吸雜志，2022，277：811-814.2端木宏謹(jǐn).加強(qiáng)對(duì)耐藥結(jié)核病的研究j.中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23(2)：69-70.3jhngrftn.耐藥性結(jié)核病管理的指導(dǎo)方針j.世界衛(wèi)生組織出版，衛(wèi)生部結(jié)核病控制中心編譯，1999.4呂斌，徐順清，陳志飛.用重組噬菌體檢測(cè)結(jié)核菌耐藥