細菌內(nèi)毒素檢查2.凝膠法檢查技術(shù)

1、凝膠法檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2017年5月1凝膠法BET定義2凝膠法BET試驗程序3試驗器具4鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗5干擾試驗6檢查法凝膠法檢查技術(shù)2（一）凝膠法BET定義定義：通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。實驗方法： 30.1ml鱟試劑溶液0.1ml供試品溶液371 602min陽性（+）陰性（-）+（一）凝膠法BET定義 結(jié)果判斷陽性：凝膠不變形、不從管壁滑脫者陰性：未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者4（）（+）（二）凝膠法BET的試驗程序試驗準(zhǔn)備確定樣品內(nèi)毒素限值選擇試劑計算MVD鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗供試品干擾初篩試驗干擾試

2、驗日常檢查結(jié)果判斷5（三）試驗材料和器具1.設(shè)備恒溫儀器： 如干式恒溫儀、恒溫水浴箱旋渦混合器-混勻細菌內(nèi)毒素溫度計冰箱計時器或時鐘微量移液器6需要定期校準(zhǔn)！1.設(shè)備恒溫干燥箱 -具有250以上恒溫的功能 -驗證：細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗 最差裝載運行3次（新）； -驗證周期：每年一次； -檢測（建議）：用具細菌內(nèi)毒素含量和干擾情況； 7TAL-40型試管恒溫儀的特點溫控精確：370.2發(fā)熱均勻：0.1可定時及提示：099分鐘任意設(shè)定時，到時蜂鳴提示試管免封口，無水蒸氣或水滴影響體積小巧，使用方便8內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（RSE或CSE）細菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法鱟試劑其他輔劑（抗增液、稀釋劑、稀釋劑和分散

3、劑等）92.試劑用具分類試驗用具名稱反應(yīng)試管無熱原玻璃試管（外徑10mm75mm）稀釋容器稀釋試管、無熱原安瓿(2ml/支，5ml/支）移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭等其他試管架、安瓿架、70%異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標(biāo)記筆等3.試驗用具10凡是與供試品或反應(yīng)試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。（四）鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗實驗室的條件實驗人員的操作技能實驗所用試劑實驗所用器具 11驗證是否滿足BET實驗的要求實驗?zāi)康模ㄋ模c試劑靈敏度復(fù)核試驗試驗步驟 12開啟恒溫儀預(yù)熱溶液C的制備鱟試劑的制備加樣恒溫反應(yīng)結(jié)果判斷數(shù)據(jù)處理操作步驟示意圖稀釋為2、0.5、

4、0.25內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(C溶液)混勻*BET水復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：RSE或CSE按說明書要求鱟試劑單次試驗試劑：原安瓿大裝量試劑：反應(yīng)試管鱟試劑復(fù)溶液復(fù)溶混勻輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合至少30秒130.1ml鱟試劑0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1ml鱟試劑0.1mlBET水，平行2管混勻（水浴恒溫需封口）371，孵育60min2min操作步驟示意圖14 結(jié)果判斷： 反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180 陽性（+）：凝膠不變形，不從管壁滑脫者 陰性（-）：未形成凝膠或凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者 實驗有效： NC管全部陰性（） 2.0管全部陽性（） 0.25管全部陰性（）數(shù)據(jù)處理：

5、靈敏度測定值c =antilg（X/n）X：為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）鱟試劑靈敏度標(biāo)示值有效：2c0.5反應(yīng)終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度靈敏度復(fù)核試驗舉例試劑信息試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價數(shù)量鱟試劑安度斯0.1ml/支(1.25ml/支)0.25EU/ml18支(2支)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(CSE) 安度斯10EU/支1BET水 (W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1151.試驗前，將恒溫儀預(yù)熱至37 ；2.0ml30s2.0ml2.0ml單位(EU/mL)30s130s0.4ml3.6ml10CSEBET水1.0ml混合5分鐘30s2.0ml2.0ml2.0

6、ml0.5(2 )0.25( )2.0ml30s2.0ml0.125(0.5)0.06(0.25 )2.標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液C的制備；163.鱟試劑的準(zhǔn)備(單次試驗試劑)取0.1ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對照溶液D兩管，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列；用精確移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解分別加入0.1mL BET水復(fù)溶173.鱟試劑的準(zhǔn)備(大裝量試劑)取1.25ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑2支，在安瓿頸部折斷，用精確移液器準(zhǔn)確吸取1.25mlBET水分別加入兩支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解。取1

7、8支（1075）mm反應(yīng)試管，按照陰性對照溶液D兩管，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列：把兩支鱟試劑合并后，分別取0.1ml鱟試劑溶液分裝到18支反應(yīng)試管中。分別加入0.1mL 復(fù)溶后的鱟試劑溶液184.加樣用精確移液器分別吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液C，加入復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿（或分裝有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)試管）中，每濃度平行4管，吸取0.1mlBET水（溶液D）加入另外兩管，作為陰性對照；0.06EU/ml分別加入CSE 0.1mLBET水0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU

8、/ml鱟試劑原安瓿反應(yīng)試管加樣順序從低濃度到高濃度195.恒溫反應(yīng)將加樣完的鱟試劑混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），垂直放入371的恒溫器中孵育602分鐘（孵育過程中避免振動影響凝膠形成）若恒溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進入反應(yīng)管內(nèi)造成污染20結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180 陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫 陽性陰性6.結(jié)果判斷216.結(jié)果判斷22試驗符合要求的基本條件： NC管全部陰性 （）2管全部陽性 （） 0.25管全部陰性 （）當(dāng) c 在0.52（包括0.5和2）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試

9、劑的靈敏度。7.數(shù)據(jù)處理舉例0.125平行管內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(EU/ml)NC反應(yīng)終點濃度X（lg反應(yīng)終點濃度）0.50.250.0610.1250.90320.250. 60230. 60240.250. 6020.2523c =antilg（X/n） =antilg(0.903)(0.602)(0.602)(0. 602)/4 = 0.210EU/ml 即本批號鱟試劑的復(fù)核靈敏度（ c ）為0.210EU/ml結(jié)論：本批鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定。7.數(shù)據(jù)處理舉例24何時需做這個試驗?zāi)兀?、使用新批號的鱟試劑2、試驗條件有任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變 25(五）干擾試驗?zāi)康模捍_定供試品

10、在某種濃度下是否適合做細菌內(nèi)毒素檢查。原理：通過比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對BET檢查有干擾。至少對3批樣品進行干擾試驗26(五）干擾試驗-反應(yīng)項目設(shè)置27編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12221240.5280.252D無/檢查用水2(五）干擾試驗-反應(yīng)項目設(shè)置注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。供試品溶液要求：未檢驗出內(nèi)毒素的溶液即不與所用鱟試劑產(chǎn)

11、生堅實凝膠；不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液。如有可能，請留一個安全系數(shù)。28(五）干擾試驗結(jié)果判斷： 當(dāng)溶液A和溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗要求時，試驗方為有效。 當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。 29 新品種建立方法-兩個廠家鱟試劑 鱟試劑的來源改變 鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變 供試品的來源改變 供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變 試驗環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗結(jié)果的變化在何種情況下需做干擾試驗？30試驗步驟試驗材料的準(zhǔn)備供試品限值的確定鱟試劑的選擇MVD的計算反應(yīng)溶液的制備加樣及反應(yīng)結(jié)果判斷3

12、1(五）干擾試驗干擾試驗通常分為兩個階段：干擾初篩試驗初步篩選出供試品無干擾濃度范圍和鱟試劑靈敏度范圍；非藥典要求！干擾試驗32(五）干擾試驗經(jīng)常接到用戶的咨詢電話，樣品日常檢查需要選擇什么靈敏度的鱟試劑來檢測？例如：我們產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素限值是0.06EU，需要訂什么靈敏度的鱟試劑，0.03可以嗎？A、細菌內(nèi)毒素限值單位不明確，是EU/ml還是EU/mg還是？單位不同，選擇鱟試劑靈敏度范圍不同；B、0.03EU/ml的鱟試劑可不可以，要做干擾試驗來確定；C、通?？上茸龈蓴_初篩試驗，初步篩選出鱟試劑靈敏度和無干擾濃度范圍，再做干擾試驗確認。331.干擾初篩試驗?zāi)康募霸肀驹囼炇撬幤放c鱟試劑相容性

13、的篩選試驗，通過對一系列含2內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出樣品對鱟試驗無干擾的濃度本試驗不是藥典規(guī)定的試驗34試驗步驟試驗材料的準(zhǔn)備供試品限值的確定從國家藥品標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中查出L按公式計算：L=K/M試劑的選擇可使用任一靈敏度的鱟試劑；一般為了試驗的方便，選擇靈敏度低的鱟試劑；35試驗步驟供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定例：某樣品的內(nèi)毒素限值為0.5EU/ml，則可以稀釋的倍數(shù)和濃度范圍如下36靈敏度（EU/ml)0.50.250.1250.060.03MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.03稀釋倍數(shù)124816試驗步驟反應(yīng)溶液的制備溶液A：將供試品

14、稀釋至鱟試劑常規(guī)靈敏度下所對應(yīng)的MVD溶液B：含2濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A溶液C： 2濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液溶液D：BET水37試驗步驟加樣及反應(yīng)0.1ml鱟試劑溶液+0.1ml各反應(yīng)溶液，各平行2管；結(jié)果判斷試驗有效條件：溶液D：（- -）；溶液C：（+ +）；無抑制干擾： 溶液A：（- -）；溶液B：（+ +）38舉例：苦參素原料藥干擾初篩試驗（1）供試品限值企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)：0.2EU/mg39（2）試劑為了方便試驗，干擾初篩試驗中一般選擇靈敏度較低的鱟試劑作試驗。試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價數(shù)量鱟試劑安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE） 安度斯10EU/支1BET水（W

15、） 安度斯50ml/瓶0.003EU/ml140（3）最大有效稀釋倍數(shù)的確定最小有效濃度計算：C=/L使用=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時， =因此可計算出使用不同時所對應(yīng)的C：靈敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應(yīng)的濃度（mg/ml）2.51.250.6250.3130.1560.5EU/ml 0.20EU/mg=2.5mg/ml41C0.5（4）各反應(yīng)溶液的制備注: S2.5表示供試品2.5mg/ml，下標(biāo)表示供試品濃度; E0.5 表示內(nèi)毒素的濃度為0.5EU/ml。溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管溶

16、液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管42溶液C的制備溶液A43備用液E100.5ml0.5ml WE0.5溶液C： E2溶液A的制備1.4mlW1.4mlS0.313S101.4ml1.4ml WS51.4ml1.4ml WS2.51.4ml1.4ml WS1.251.4ml1.4ml WS0.6250.4ml3.6ml WE1備用液53.5mg5.35mlW混合1.0ml1.0mlS0.1560.5mlS5+0.5mlE1 1.0mlS2.5E0.50.5mlS2.5+0.5mlE1 1.0m

17、lS1.25E0.50.5mlS1.25+0.5mlE1 1.0mlS0.625E0.50.5mlS0.625+0.5mlE1 1.0mlS0.313E0.50.5mlS0.313+0.5mlE1 1.0mlS0.156E0.5更簡單的干擾初篩試驗溶液B制備方法：0.01mlE20+0.1ml供試品溶液+0.1ml鱟試劑溶液44溶液B： SE2注意事項：制備溶液C和B時，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒。溶液B的制備（5）加樣及反應(yīng)開啟24支鱟試劑，分別用移液器準(zhǔn)確吸取0.1ml BET水將鱟試劑復(fù)溶取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管另外取0.1ml B

18、ET水作為陰性對照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管371反應(yīng)602分鐘45（6）結(jié)果判斷 當(dāng)溶液D為陰性；溶液C為陽性時，試驗有效結(jié)果1：溶液A系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性，溶液B系列全部是陽性結(jié)果2：溶液A系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性，溶液B系列在某一濃度處才開始是陽性結(jié)果3：溶液A系列與溶液B系列反應(yīng)的結(jié)果全是陽性結(jié)果4：溶液A系列與溶液B系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性46（6）結(jié)果判斷結(jié)果1：溶液A系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性，溶液B系列全部是陽性47溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5

19、 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+48（6）結(jié)果判斷結(jié)果1解讀：供試品無干擾或干擾很小，可使用上述任一濃度進行干擾試驗。（6）結(jié)果判斷結(jié)果2：溶液A系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性，溶液B系列在某一濃度處才開始是陽性49溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+-+-+50（6）結(jié)果判斷結(jié)果2解讀：供試品在某濃度開始無干擾，可選擇該濃度或梯度遞減的更低濃度（不超過MVD）進行干擾試驗。

20、通常建議選擇梯度遞減下一個濃度，以防干擾狀況處于臨界水平。對于本例子，建議選擇S0.625。（6）結(jié)果判斷結(jié)果3：溶液A系列與溶液B系列反應(yīng)的結(jié)果全是陽性51溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管+-+-+52（6）結(jié)果判斷結(jié)果3解讀：樣品內(nèi)毒素含量高或增強（假陽性）。對于前者，建議更換另一批供試品進行測試。對于后者，消除干擾后再進行測試（比如使用抗增液等消除增強干擾的手段）。用光度測定法檢測分析確定是

21、內(nèi)毒素含量還是增強作用。（6）結(jié)果判斷結(jié)果4：溶液A系列與溶液B系列反應(yīng)的結(jié)果全是陰性53溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+-+54（6）結(jié)果判斷結(jié)果4解讀：強抑制（假陰性） 。消除干擾后再進行測試。如無法消除干擾，該供試品可能不適合使用凝膠法進行檢測。可選擇其他方法，如顯色基質(zhì)法。（6）結(jié)果判斷-本試驗結(jié)果55溶液編號AD溶液內(nèi)容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156

22、W平行管 溶液編號BC溶液內(nèi)容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽性，試驗有效；溶液B系列中，第一個出現(xiàn)陽性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無干擾濃度。本試驗中的樣品無干擾濃度為 S2.5 2.干擾試驗舉例：苦參素原料藥干擾試驗（1）供試品限值企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：細菌內(nèi)毒素含量0.2EU/mg56（2）試劑的選擇根據(jù)干擾初篩試驗的結(jié)果，供試品在2.5mg/ml（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為0. 5EU/ml）時無干擾;這里我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑對2.5mg/ml供試品進行干擾

23、驗證試驗。 Why？57預(yù)留4倍安全系數(shù)（2）試劑的選擇試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價數(shù)量鱟試劑安度斯0.1ml/支0.125EU/ml28內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE） 安度斯10EU/支1BET水 （W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1（3）最小有效濃度的計算MVC=/L=0.625mg/ml58溶液編號BA溶液內(nèi)容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03 S2.5平行管數(shù)（4）各反應(yīng)溶液的制備溶液編號 CD溶液內(nèi)容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管數(shù)59ChP（2010年）平行管數(shù)4ChP( 2015年)平行管數(shù)2溶液C的制備0

24、.4ml30s10CSEBET水1.0ml1.8ml1.03.6ml30s30s30s1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml30s1.8ml1.8ml(EU/ml)溶液C混合5分鐘0.25(2 )0.125( )0.06(0.5)0.03(0.25 )0.5(4 )60溶液A的制備61溶液A：S2.5BET水苦參素原料藥53.5mg5.35mlS102.0ml2.0 ml0.5ml0.5 mlS5混合溶液B的制備E0.5S50.5ml0.5mlS2.5E0.25E0.25S50.5ml0.5mlS2.5 E0.125E0.125S50.5ml0.5mlS2.5

25、E0.06E0.06S50.5ml0.5mlS2.5 E0.0362（5）加樣及反應(yīng)開啟64支鱟試劑，先分別用0.1ml BET水復(fù)溶,再分別加相應(yīng)的溶液0.1ml（A、B、C和D）37 1反應(yīng)602分鐘0.25EU/ml(2)0.125EU/ml()0.06EU/ml()0.03EU/ml()BET水S2.5 E0.25(SE2)S2.5 E0.125(SE)S2.5 E0.06(SE)S2.5 E0.03(SE)S2.563（6）結(jié)果判斷批號1-試驗結(jié)果溶液編號 CD溶液內(nèi)容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管數(shù)溶液編號BA溶液內(nèi)容 S2.5E0.25 S2.5E0.

26、125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管數(shù)+64試驗有效+（6）結(jié)果判斷批號2-試驗結(jié)果溶液編號 CD溶液內(nèi)容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管數(shù)溶液編號BA溶液內(nèi)容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管數(shù)+65試驗有效+（6）結(jié)果判斷批號3-試驗結(jié)果溶液編號 CD溶液內(nèi)容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管數(shù)溶液編號BA溶液內(nèi)容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管數(shù)+66試驗有效+結(jié)果計算及判斷c =antil

27、g（2(lg0.125) 2）= 0.125 EU/ml67計算鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列，c：計算干擾試驗系列， B ：）= 0.086 EU/mlB2 =antilg（(lg0.06) 2 +(lg0.125) 24）= 0.125 EU/mlB3 =antilg（(lg0.125) 44）= 0.104 EU/mlB1 =antilg（(lg0.06) +(lg0.125) 34 本試驗： 溶液D：（- -） ； 溶液A：（- -） ； 用水稀釋內(nèi)毒素系列： 2管：（+ +） ；0.25管：（- -） ； c=0.125，0.5 c 2，試驗有效! 用供試品稀釋內(nèi)毒素系列：三批樣品B：0

28、.104/0.086/0.125； 0.5 c 2 。結(jié)論：使用靈敏度=0.125EU/ml的鱟試劑對樣品(S)的濃度為2.5mg/ml的稀釋液(S2.5)作BET，無干擾。結(jié)果計算及判斷682.干擾試驗若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。69問題討論-溶液B的制備A、等比稀釋法：取等量的濃度為4的內(nèi)毒素溶液和濃2倍的供試品溶液，混合；例如制備 S80E0.25，取等量的0.5EU/ml內(nèi)毒素溶液和40倍供試品溶液混合B、用供試品代替水稀釋內(nèi)毒素：例如制備S80E0.25 ，先用BET水溶解內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品再用80倍的供試品

29、溶液稀釋至需要的內(nèi)毒素溶液； S80E0.25：80倍的供試品溶液含0.25EU/ml的內(nèi)毒素溶液采用方法B制備，第一步要稀釋10倍！70（六）檢查法凝膠限度試驗 反應(yīng)項目設(shè)置編號內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液2B2供試品溶液2C2檢查用水2D無檢查用水271 注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照； C為陽性對照； D為陰性對照反應(yīng)項目意義溶液D：陰性對照監(jiān)控試驗是否受到外源性內(nèi)毒素的污染，包括水、鱟試劑、用具和試驗操作；平行兩管都應(yīng)為陰性，其中有一管為陽性，試驗無效；外源性內(nèi)毒素的含量小于使用鱟試劑的靈敏度72反應(yīng)項目意義溶液C：陽性對照監(jiān)控鱟試劑的靈敏度、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的

30、效價和稀釋是否準(zhǔn)確、恒溫設(shè)備、用具是否存在干擾、人員操作是否準(zhǔn)確和試驗環(huán)境是否合適；平行兩管都應(yīng)為陽性，否則試驗無效；為什么加入2濃度的內(nèi)毒素，加入不是更好嗎？-標(biāo)示值范圍！73反應(yīng)項目意義溶液B：供試品陽性對照監(jiān)控供試品是否有抑制作用，防止由于供試品有抑制作用而放行不合格產(chǎn)品；平行兩管必須都為陽性，否則試驗無效。74反應(yīng)項目意義溶液A：供試品溶液確定在檢測靈敏度是否有內(nèi)毒素出現(xiàn)；陽性：供試品內(nèi)毒素含量靈敏度稀釋倍數(shù)陰性：供試品內(nèi)毒素含量靈敏度稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)不超過MVD；75（六）檢查法凝膠法限度試驗結(jié)果判斷 溶液A溶液D溶液C溶液B符合規(guī)定- - -+ + +不符合規(guī)定+ +- -+ +

31、+需復(fù)測+ - -+ + +復(fù)測符合規(guī)定- - - - -+ + +復(fù)測不符合規(guī)定+ - - - -+ + +76結(jié)果判斷試驗有效！若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD，需將供試品稀釋至MVD重新實驗，再對結(jié)果進行判斷。試驗步驟試驗材料的準(zhǔn)備供試品限值的確定試劑的選擇MVD的計算反應(yīng)溶液的制備加樣及反應(yīng)結(jié)果判斷77舉例：苦參素原料藥凝膠限度試驗1.供試品限值企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素含量0.2EU/mg78根據(jù)干擾試驗結(jié)果，供試品在2.5mg/ml，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對BET無干擾本試驗選擇鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml，供試品稀釋至2.5mg/ml檢測2.試劑試劑名稱廠家規(guī)

32、格靈敏度或效價數(shù)量鱟試劑安度斯0.1ml/支0.125EU/ml8CSE安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1苦參素原料藥(S)793.各反應(yīng)溶液制備E0.5S50.6ml0.6mlS2.5 E0.25805.35mlWS101.0ml1.0ml WS50.6ml0.6ml WS2.5E100.4ml3.6ml WE11.6ml1.6ml WE0.50.6ml0.6ml WE0.25溶液C溶液A溶液B53.5mg混合4.加樣及反應(yīng)開啟8支鱟試劑，分別加0.1mlBET水復(fù)溶；再分別加入相應(yīng)的溶液，每濃度平行2管37 1反應(yīng)602分鐘溶液D（W）溶液C（ E0

33、.25 ）溶液A（ S2.5 ）溶液B（ S2.5 E0.25 ）各0.1mL各0.1mL各0.1mL各0.1mL81當(dāng)需要復(fù)檢時，A溶液平行4管，若所有平行管均為陰性，則供試品合格；否則不合格。無法判斷：稀釋至0.625mg/ml重新試驗，再判斷。溶液編號ABCD溶液內(nèi)容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W試驗有效合格無法判斷需復(fù)檢復(fù)檢合格復(fù)檢不合格+5.結(jié)果判斷82溶液編號ABCD溶液內(nèi)容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W結(jié)果+5.結(jié)果判斷83試驗有效樣品內(nèi)毒素含量0.125EU/ml/2.5mg/ml =0.05EU/mg結(jié)論：樣品的內(nèi)毒素含量小于0.05EU/mg，限值為

34、0.2EU/mg，符合規(guī)定。0.2/0.05=4,提供4倍安全系數(shù)5.結(jié)果判斷84試驗有效樣品內(nèi)毒素含量0.125EU/ml/2.5mg/ml =0.05EU/mg結(jié)論：樣品的內(nèi)毒素含量大于等于0.05EU/mg，限值為0.2EU/mg，無法判斷。需將供試品稀釋至0.625mg/ml重新試驗再判斷。溶液編號ABCD溶液內(nèi)容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W結(jié)果+（六）檢查法-凝膠半定量試驗?zāi)z半定量試驗系通過確定反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按下表制備溶液A、B、C、D。按照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。 85（六）檢查法-凝膠半定量試驗編號內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用

35、液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12482222B2/供試品溶液122C2/檢查用水檢查用水1248210.50.252222D無/檢查用水286注： A為不超過MVD并且通過干擾實驗的供試品溶液。從 通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD 。 B為含2濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照） C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列 D為陰性對照（六）檢查法-凝膠半定量試驗87結(jié)果判斷88試驗有效條件 溶液D： 溶液B： 溶液C：0.5c 2 結(jié)果計算系列溶液A中每一系列的終點稀釋倍數(shù)乘以 ，為每個系列的反應(yīng)終點濃度（如

36、果檢驗的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點濃度乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)）。即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度CE=antilg（C/2）（六）檢查法-凝膠半定量試驗若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定；若供試品溶液的所有平行管均為陰性，供試品溶液的內(nèi)毒素濃度小于乘以初始稀釋倍數(shù)；若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時，判定供試品不符合規(guī)定。當(dāng)供試品溶液的所有平行管均為陽性時，供試品溶液內(nèi)毒素濃度大于或等于乘以最大稀釋倍數(shù)。（六）檢查法-凝膠半定量試驗89舉例：氯化鈉注射液凝膠半定量試驗 1.內(nèi)毒素限值氯化鈉注射液(S),規(guī)格：250ml/2.25g;藥典要求：氯化鈉注射液的內(nèi)毒素限值 L=0.50EU/ml 2. 試劑試劑名稱廠家規(guī)格靈敏度或效價數(shù)量鱟試劑安度斯0.1ml/支0.06EU/ml20內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml190舉例：氯化鈉注射液凝膠半定量試驗 3. MVD的計算 MVD=CL/ =1.0ml/ml0.50EU/ml/0.06EU/ml =8(倍）4.各反應(yīng)溶液的制備溶液C的制備：將CSE稀釋成E1.2